快速藥敏檢測(cè)技術(shù)方法、原理、臨床轉(zhuǎn)化需求（一）
在全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域，微生物耐藥問題正以嚴(yán)峻態(tài)勢(shì)威脅人類健康，成為亟待解決的重大挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織于2011年率先發(fā)出“今天不采取行動(dòng)，明天就無藥可用！”的警示，呼吁全球遏制微生物耐藥；G20峰會(huì)多次將細(xì)菌耐藥問題納入議程，“世界提高抗微生物藥物認(rèn)識(shí)周”歷經(jīng)十年持續(xù)宣傳，我國(guó)亦出臺(tái)多項(xiàng)政策舉措推進(jìn)耐藥防控工作。當(dāng)前，全球已就微生物耐藥的嚴(yán)重性與應(yīng)對(duì)緊迫性達(dá)成共識(shí)，而合理使用抗菌藥物作為防控核心，其實(shí)施高度依賴快速、精準(zhǔn)的藥敏檢測(cè)技術(shù)支撐。
傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)與藥敏檢測(cè)流程往往需要2～3天，部分復(fù)雜菌株檢測(cè)周期更長(zhǎng)，這一滯后性嚴(yán)重制約臨床醫(yī)生對(duì)抗菌藥物的精準(zhǔn)選擇，延緩患者救治進(jìn)程。相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療無效的感染患者，每延遲1小時(shí)使用正確藥物，其死亡率將上升10%[1]。由此可見，研發(fā)兼具快速性與準(zhǔn)確性的藥敏檢測(cè)技術(shù)，不僅是指導(dǎo)臨床合理用藥、提升患者治療效果的關(guān)鍵，更是減緩微生物耐藥發(fā)展速度的重要手段。
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF MS）在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了鑒定時(shí)間從小時(shí)級(jí)到分鐘級(jí)的突破，但藥敏檢測(cè)效率仍未得到同步提升。為縮短藥敏報(bào)告周期，研究者嘗試優(yōu)化藥敏檢測(cè)前處理環(huán)節(jié)，以替代傳統(tǒng)耗時(shí)的菌落純培養(yǎng)過程，例如采用4～6小時(shí)培養(yǎng)形成的菌膜[2]、通過短時(shí)增菌制備符合藥敏檢測(cè)要求的菌懸液[3]、利用離心富集技術(shù)直接將臨床標(biāo)本中的細(xì)菌導(dǎo)入藥敏檢測(cè)流程[4]等。然而，這些方法僅在流程上進(jìn)行局部?jī)?yōu)化，未能從根本上突破傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的效率瓶頸。
為推動(dòng)快速藥敏技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）于2018年推出紙片法血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶直接快速藥敏試驗(yàn)（RAST）方案，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）也在2021年發(fā)布同類方案[56]。其中，EUCAST方案可在4～8小時(shí)內(nèi)出具藥敏結(jié)果，CLSI方案則需8～10小時(shí)。但受限于技術(shù)原理，RAST方法需依賴專屬藥敏折點(diǎn)，目前僅適用于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等常見革蘭陰性桿菌，以及金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌（EUCAST已建立上述陽(yáng)性球菌的RAST折點(diǎn)，CLSI暫未明確），難以覆蓋更多細(xì)菌種類與抗菌藥物，臨床應(yīng)用范圍受限。
熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）、基因芯片、全基因組測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)，以及膠體金免疫層析法等免疫學(xué)技術(shù)，雖能在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得藥敏結(jié)果，但這類技術(shù)僅針對(duì)已知耐藥基因或耐藥蛋白設(shè)計(jì)檢測(cè)靶點(diǎn)，無法識(shí)別新型耐藥機(jī)制或非典型耐藥菌株，難以滿足臨床對(duì)廣譜藥敏檢測(cè)的需求。因此，若要開發(fā)適用于臨床常見病原菌、可覆蓋所有藥敏試驗(yàn)需求，且兼顧準(zhǔn)確性與快速性的檢測(cè)技術(shù)及設(shè)備，必須突破傳統(tǒng)技術(shù)路徑，實(shí)現(xiàn)顛覆性創(chuàng)新。
當(dāng)前新型快速藥敏檢測(cè)技術(shù)的核心設(shè)計(jì)思路，是將微生物生長(zhǎng)觀察的時(shí)間點(diǎn)前移——在藥敏孵育早期，微生物尚未形成肉眼可見菌落時(shí)，借助高精度設(shè)備與先進(jìn)技術(shù)，捕捉微生物在數(shù)量、形態(tài)、代謝等方面的細(xì)微變化，進(jìn)而判斷微生物與抗菌藥物的耐受關(guān)系。以下從四類技術(shù)方向展開詳細(xì)闡述，并重點(diǎn)分析丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)oCelloScope在該領(lǐng)域的技術(shù)應(yīng)用與核心優(yōu)勢(shì)。
一、基于微生物生長(zhǎng)現(xiàn)象觀察的快速藥敏技術(shù)
此類技術(shù)的核心邏輯的是通過直接捕捉微生物生長(zhǎng)過程中的數(shù)量變化與形態(tài)特征，實(shí)現(xiàn)藥敏結(jié)果的早期判斷。其關(guān)鍵技術(shù)突破在于借助高精度檢測(cè)設(shè)備，放大微生物生長(zhǎng)的早期信號(hào)，打破傳統(tǒng)肉眼觀察的局限，大幅縮短檢測(cè)周期。
1.1電阻抗單細(xì)胞計(jì)數(shù)法
該技術(shù)以微量肉湯稀釋法為基礎(chǔ)，僅需2小時(shí)孵育即可通過電阻抗信號(hào)分析細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)。其檢測(cè)原理為：在專用檢測(cè)池內(nèi)，正負(fù)電極構(gòu)建穩(wěn)定電流場(chǎng)，自動(dòng)探針將待檢菌液吸入檢測(cè)池；當(dāng)細(xì)菌通過電極間的微小通道時(shí)，會(huì)導(dǎo)致局部電阻瞬時(shí)升高，形成脈沖信號(hào)——通過統(tǒng)計(jì)脈沖信號(hào)的數(shù)量可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌計(jì)數(shù)，通過分析脈沖振幅的大小可評(píng)估細(xì)菌體積。結(jié)合不同藥物濃度藥敏孔的檢測(cè)結(jié)果，即可計(jì)算得出藥物的最低抑菌濃度（MIC）[7]。該技術(shù)不僅適用于純培養(yǎng)菌落的藥敏檢測(cè)，還可直接處理血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本與單純性尿路感染患者的尿液標(biāo)本，無需額外純化步驟，進(jìn)一步拓展了臨床應(yīng)用場(chǎng)景。
1.2單細(xì)胞形態(tài)分析技術(shù)
該技術(shù)通過高精度光學(xué)系統(tǒng)追蹤單個(gè)病原微生物細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)合智能算法處理圖像數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)藥敏結(jié)果的快速判斷。其中，微流控技術(shù)與光學(xué)檢測(cè)的結(jié)合是當(dāng)前主流技術(shù)路徑：通過調(diào)節(jié)微流控系統(tǒng)的流體閥，可精準(zhǔn)控制菌液流動(dòng)速度與方向，配合光學(xué)檢測(cè)模塊實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)追蹤，最短30分鐘即可獲得MIC值[89]；另有研究將微生物固定于含抗菌藥物的瓊脂糖凝膠中，通過顯微鏡進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像，3～4小時(shí)內(nèi)可完成藥敏結(jié)果判讀[10]。
此外，Zhang等學(xué)者開發(fā)的散射成像系統(tǒng)，可直接追蹤尿液標(biāo)本中單個(gè)細(xì)菌的分裂過程，通過分析細(xì)菌分裂頻率與形態(tài)變化，1小時(shí)內(nèi)即可出具藥敏結(jié)果[11]；還有研究者設(shè)計(jì)的微流控芯片單細(xì)胞藥敏檢測(cè)技術(shù)，可在2小時(shí)內(nèi)完成7種細(xì)菌混合樣本的藥敏分析，有效解決了復(fù)雜樣本中多菌株同時(shí)檢測(cè)的難題[12]。
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