副溶血弧菌活菌計數(shù)方法：MTT比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長曲線法（三）
2實驗結(jié)果
2.1 MTT比色法
2.1.1檢測波長
MTT經(jīng)細菌產(chǎn)物呈藍紫顏色，將培養(yǎng)的副溶血弧菌懸液進行波長掃描(圖1)，結(jié)果顯示，藍紫色產(chǎn)物的最大吸收峰值在550~560 nm之間。DMSO的吸光度對實驗組吸光度影響很小，且沒有峰值出現(xiàn)，屬于背景吸收，因此，將MTT法的檢測波長定為555 nm。
圖1 MTT產(chǎn)物甲瓚的光吸收檢測波長掃描
2.1.2 MTT溶液的使用劑量
設(shè)定不同的MTT用量進行分析，結(jié)果顯示(圖2)，當細菌反應(yīng)液中MTT濃度為0.2 mg/ml，產(chǎn)生甲瓚沉淀的量最多，甲瓚的吸收曲線呈現(xiàn)峰值，因此，將MTT終濃度定為0.2 mg/ml。MTT量超過0.2 mg/ml時，產(chǎn)生的甲瓚量會逐漸減少。
圖2 MTT濃度對檢測結(jié)果的影響
2.1.3干擾物的影響
以DMSO為參照，用PBS或滅活菌體作為樣品進行MTT反應(yīng)檢測，所得的檢測值很低(表1)，經(jīng)t檢驗，得出3組數(shù)據(jù)兩兩間均無顯著差異(P>0.05)，因此，可以忽略這些干擾物對實驗結(jié)果的影響。
表1不同干擾物以DMSO為對照時的OD值
2.1.4反應(yīng)時間的影響
細菌與MTT的反應(yīng)時間在0.5~2 h時，形成甲瓚的量在逐漸增多，2 h后維持在相對穩(wěn)定的數(shù)量(圖3)，因此，將反應(yīng)時間定為2 h。
圖3反應(yīng)時間對檢測結(jié)果的影響
2.1.5檢測范圍
通過選擇上述參數(shù)，用優(yōu)化的MTT法在微孔板中進行副溶血弧菌的高通量活菌計數(shù)，用SigmaPlot的Polynomial線性分析，當菌液濃度為7.81×106~2.50×108 CFU/ml時，其對應(yīng)的OD555 nm值與活菌數(shù)的線性關(guān)系極顯著，線性范圍跨度約為2個細菌濃度數(shù)量級，其關(guān)系式為LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125)，R2=0.9965(圖4)。
圖4菌液濃度對數(shù)LgC與OD值對數(shù)LgOD555 nm的標準曲線
2.2 ATP生物發(fā)光法
2.2.1 ATP標準溶液的標準曲線
用增強型ATP檢測試劑盒對ATP標準溶液進行檢測，ATP標準溶液濃度在1.0×10?1~1.0×104 nmol/L時，ATP濃度的對數(shù)(LgATP)與發(fā)光強度對數(shù)(LgRLU)的線性關(guān)系極顯著，其關(guān)系式為LgATP=1.0509LgRLU-4.3223，R2=0.9974(圖5)，表明該試劑盒在該范圍內(nèi)的測定結(jié)果可靠。
圖5 ATP濃度對數(shù)(LgATP)與相對發(fā)光強度(RLU)對數(shù)(LgRLU)的標準曲線
2.2.2菌液濃度對數(shù)LgC與相對發(fā)光強度對數(shù)LgRLU的標準曲線
用增強型ATP試劑盒對已知濃度的副溶血弧菌樣品進行檢測，用SigmaPlot的Polynomial線性分析，當菌液濃度在1.0×104~3.0×108 CFU/ml時，其對應(yīng)的相對發(fā)光強度對數(shù)(LgRLU)與活菌數(shù)對數(shù)(LgC)的線性關(guān)系極顯著，線性范圍跨度約為4.5個細菌濃度數(shù)量級，其關(guān)系式為LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366)，R2=0.9994(圖6)。
圖6菌液濃度對數(shù)LgC與相對發(fā)光強度對數(shù)LgRLU的標準曲線
2.3高通量生長曲線法
將濃度為1.0×100~1.0×107 CFU/ml的副溶血弧菌加到預(yù)先加有培養(yǎng)基的多孔板中，每隔1 h，測定OD600 nm值，扣除未接種細菌孔的OD600 nm后，得出各初始濃度的細菌吸光度所代表的生長變化，可看到這些生長變化都呈S形(Sigmoid)曲線分布，不同濃度的S曲線在拐點處的生長速率基本接近，經(jīng)SigmaPlot的Sigmoid曲線類型3參數(shù)模式擬合，得到各初始濃度的細菌生長曲線(圖7)。用SigmaPlot的Polynomial線性分析，取各濃度擬合曲線的拐點時間參數(shù)(Ts)，即為生長達到最大值的50%的生長時間，該時間在所測定的初始細菌濃度范圍內(nèi)均與活菌數(shù)的對數(shù)值(LgC)具有極顯著的線性關(guān)系，線性關(guān)系跨度達7個數(shù)量級，其關(guān)系式為LgC=–(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572)，R2=0.9924(圖8)。
圖7各初始濃度菌液的生長曲線
圖8菌液濃度LgC與生長曲線的拐點時間(Ts)的標準曲線
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