不同保存條件、培養基對淋病奈瑟菌存活率的影響——摘要、材料與方法
摘要： 目的 優化淋病奈瑟菌（簡稱淋球菌）的分離培養及保存方法。方法 采用自制淋球菌選擇性培養基與7種商品化淋球菌選擇性培養基［淋球菌分離培養板、淋球菌（T-M）選擇培養基、巧克力平板（淋球菌）、淋球菌選擇培養基、MTM瓊脂平板、一次性GC瓊脂培養基、淋球菌瓊脂平板］分別培養5株質控菌（1號淋球菌、2號淋球菌、黏液奈瑟菌、糞腸球菌、混合菌），評估培養基效能。通過燭缸內、外培養法培養16株淋球菌，篩選CO2依賴型菌株；評估4種自制淋球菌保存液（10%二甲基亞砜小牛血清、10%甘油小牛血清、20%甘油腦心浸液及30%甘油胰酶大豆肉湯）保存淋球菌的效果；觀察淋球菌在凍干和未凍干狀態下的存活情況。
結果 5株質控菌株在不同的淋球菌商品化培養基上生長效果存在差異，1號淋球菌在自制培養基和MTM瓊脂平板上生長的菌落大且數量多，優于其他6種培養基；2號淋球菌在7種商品化培養基中生長情況均不如自制培養基；7種商品化培養基對黏液奈瑟菌生長均有抑制作用，其中自制培養基、巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板、一次性GC瓊脂培養基、淋球菌瓊脂平板能完全抑制其生長；淋球菌（T-M）選擇培養基能完全抑制糞腸球菌的生長；混合菌在自制培養基淋球菌分離培養板、淋球菌（T-M）選擇培養基、巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板及一次性GC瓊脂培養基等培養基上分離效果較好。在有CO?環境下，16株淋球菌均呈現出良好的生長狀態；無CO?條件下，11株淋球菌生長受到明顯的抑制。4種保存液在-70 ℃條件下保存效果未見差異，保存12個月時均可見培養菌落融合成片；在-20 ℃條件下，30%甘油胰酶大豆肉湯保存效果最好，6個月時仍有少數存活；10%二甲基亞砜小牛血清保存效果最差，2周時僅部分存活。
未凍干的淋球菌在不同溫度（4 ℃、-18 ℃、-29 ℃、-70 ℃和液氮）下的保存時間存在差異，4 ℃保存第4天即無淋球菌存活；凍干后的淋球菌在4 ℃保存6個月仍可存活（菌落融合成片）。結論 自制淋球菌選擇性培養基對淋球菌的培養及分離效果優于商品化淋球菌選擇性培養基；少量的CO2可以促進淋球菌生長；超低溫及凍干保存淋球菌可以提高淋球菌存活時間，4 ℃凍干保存是最經濟有效的長期保存方案。
引言
淋病是我國法定報告的乙類傳染病，也是我國目前重點防控的性傳播疾病之一。該病的病原體淋病奈瑟菌（簡稱淋球菌）的培養受多種因素影響，包括規范的標本取材、培養基的質量、適宜的培養溫度以及一定濃度的CO?。淋球菌除對培養條件要求苛刻，其菌株的長期保存也面臨許多困難，目前常用的脫脂牛奶保存法存在保存效果不穩定、存活時間短等問題，給淋球菌耐藥監測及其相關科研工作帶來諸多不便。雖然冷凍干燥法被認為是細菌保存的最佳方法，但其操作復雜，費時費力且設備昂貴，在淋球菌保存中的實際效果需要進一步驗證[5]。本研究旨在系統評估不同保存條件對淋球菌存活率的影響，為淋球菌的運輸、標本庫的建立及標準化管理提供科學依據。
一、材料與方法
1.菌株來源：
4株淋球菌參考菌株，編號ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL，來自世界衛生組織西太區。5株質控菌株：1號、2號為淋球菌，編號ATCC49226、WHOG，來自世界衛生組織西太區；黏液奈瑟菌（Neisseria mucosa），編號ATCC19695，糞腸球菌（Enterococcus faecalis），編號ATCC29212，來自美國典型菌種保藏中心；混合菌含1株淋球菌（編號ATCC49226）和1株糞腸球菌（編號ATCC29212）。16株淋球菌臨床分離株，編號分別為NJ08-91、NJ08-92、NJ08-93、NJ08-94、NJ08-99、NJ08-100、NJ08-101、NJ08-102、NJ08-104、NJ08-105、NJ08-106、NJ08-107、NJ08-112、NJ08-117、NJ08-118、NJ08-136，來自中國醫學科學院皮膚病醫院性病科。
2.培養基及保存試劑：
自制淋球菌選擇性培養基，成分為3.6%的GC基礎粉、0.4%的VCN抑制劑（英國Oxoid公司）、2%的Vso-Vitalex增菌劑（英國Oxoid公司）、2%的血紅蛋白粉。7種商品化淋球菌選擇性培養基分別為淋球菌分離培養板（珠海市銀科醫學工程股份有限公司）、淋球菌（T-M）選擇培養基（南京迪景生物制品有限公司）、巧克力平板（淋球菌）（廣州市景泉微生物科技有限公司）、淋球菌選擇培養基（江門市凱林貿易有限公司）、MTM瓊脂平板（上海伊華醫學科技有限公司）、一次性GC瓊脂培養基（天津市金章科技發展有限公司）、淋球菌瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。凍存基質：脫脂牛奶、甘油、二甲基亞砜、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、腦心浸液及胰酶大豆肉湯（美國BD公司）；凍干保護劑：脫脂牛奶。
3.培養基性能評估：
從4℃冰箱取出5株質控菌株，各加300μl無菌生理氯化鈉溶液后混勻，用移液器分別取出10μl菌液接種到經過預溫的自制淋球菌培養基及7種商品化淋球菌選擇性培養基，并作四區劃線培養，置于36℃培養箱中燭缸培養36 h，記錄菌落形態，包括菌落大小、透明度、純度及雜菌抑制情況。
4.CO?依賴型實驗：
從-70℃冰箱中取出4株淋球菌參考菌株（ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL）及12株臨床分離株（NJ08-92、NJ08-94、NJ08-99、NJ08-100、NJ08-101、NJ08-102、NJ08-104、NJ08-105、NJ08-106、NJ08-112、NJ08-117、NJ08-118），分別取出10μl標本平行接種于2塊淋球菌培養基，置于燭缸內（含CO?）和燭缸外（不含CO?）的培養箱中，36℃培養36 h，觀察兩組菌落生長情況。依據全國臨床檢驗操作規程判定菌落生長情況，“+”：1～10個菌落（稀疏生長）；“++”：11～100個菌落（中等生長）；“+++”：>100個菌落，但未融合（密集生長）；“++++”：菌落融合成片（無法計數）。
5.保存液效果比較：
4種淋球菌保存液分別為10%二甲基亞砜小牛血清（二甲基亞砜與小牛血清1:9）、10%甘油小牛血清（甘油與小牛血清1:9）、20%甘油腦心浸液（3.7%腦心浸液與甘油4:1）、30%甘油胰酶大豆肉湯（專利申請號：2025107655801），根據各自特點進行配制，將待測的4株參考菌株（ATCC49226、WHOG、WHOJ、WHOL）和4株臨床分離株（NJ08-91、NJ08-93、NJ08-107、NJ08-136）分離純化后，制成1×10?CFU/ml菌懸液，置于不同保存液中，各分裝數支，分別置于-20℃和-70℃的冰箱中，定期取出10μl接種于淋球菌培養基中，36℃培養36 h，觀察菌落生長情況。
6.保存方法效果比較：
參考菌株WHOJ分離純化后，制成1×10?CFU/ml的菌懸液，置于滅菌的10%脫脂牛奶中，分裝數支，將凍干和未凍干的淋球菌分別置于4℃、-18℃、-29℃、-70℃和液氮環境中保存，定期分別取出10μl接種于淋球菌培養基36℃培養36 h，觀察淋球菌的存活情況。
相關新聞推薦
2、微生物生長曲線監測系統評估不同濃度的XO和LPO對嬰兒口腔細菌生長的影響