溫帶的蠟樣芽孢桿菌噬菌體分離與鑒定
研究簡介：芽孢桿菌屬可分為兩類:枯草芽孢桿菌屬和蠟樣芽孢桿菌屬。后者的成員包括炭疽桿菌、炭疽桿菌、蠟樣桿菌、威亨斯特法氏桿菌、圖林根氏桿菌、分枝桿菌和假菌類。蠟樣芽孢桿菌和威氏芽孢桿菌與食源性疾病和食物腐敗有關。它們的催冷特性使它們在低溫貯藏的食品中產生問題，特別是在乳制品中。蘇云金桿菌、分枝桿菌和擬桿菌也被發現會導致食物變質。此外有證據表明它們可能導致食源性疾病。雖然迄今已分離出大量的芽孢桿菌噬菌體，但對蠟樣芽孢桿菌噬菌體進行了詳細的鑒定的研究較少。本論文的研究中，研究人員分離到一種溶性噬菌體vB_BceM_Bc431v3，該噬菌體具有很強的控制蠟樣芽胞桿菌的潛力。在將其應用于食品保存之前，研究人員對其進行了相關鑒定并確認其不會影響這種細菌的致病性。
本論文研究的目的是確定噬菌體Bc431v3的基因組序列，并結合科學文獻和GenBank中現有的噬菌體對其基因進行注釋和結構功能鑒定。Biosense生長曲線分析儀的高通量測試技術測定宿主特異性，研究過程中選定了芽胞桿菌屬的菌株Bc431v3，利用Biosense生長曲線分析儀，通過儀器的高通量測試技術測量在液體介質的光密度(OD)來監測細菌噬菌體的存在。
芬蘭Biosense全自動生長曲線分析儀的應用
Biosense生長曲線分析儀的高通量測試技術可用于測定噬菌體對宿主細菌的特異性。噬菌體的宿主細菌選定了芽胞桿菌屬的菌株Bc431v3，利用現場的測試技術，Biosense生長曲線分析儀的高通量測試技術測量在液體介質的光密度(OD)來監測細菌噬菌體的存在。該設備的使用設置如下:設定寬波段帶(wb)波長;25°C培養溫度;10分鐘預熱時間;動態測量;測量時間24小時，間隔30分鐘，每次測量前后中等強度搖晃10秒。50毫升的噬菌體溶菌產物轉移到已經消毒的消毒100孔Biosense蜂窩板中,然后每個孔接種125μl經過一夜培養的細菌培養液。利用Biosense生長曲線分析儀的數據處理軟件5.26版對吸光度數據進行分析，確定檢測時間(每口測試孔增加0.3 OD單位所需的時間)。將檢測時間(h:min)轉換為十進制值，取平均值，并從每個被測分離物的所有測試數據中減去平均控制檢測時間，并表示為檢測時間差。根據宿主特異性將噬菌體分為三組:(++)即噬菌體完全抑制宿主菌生長時;(+)說明噬菌體延緩了宿主細菌的生長;（-）表明噬菌體對細菌的生長沒有影響。
實驗結果：Bc431v3顯示顯著的序列相似性,在蛋白質水平到B仙人掌噬菌體BCP78、李斯特菌噬菌體A511、噬菌體?EF24C腸球菌和噬菌體感染相關的其他形態厚壁菌門如葡萄球菌噬菌體K和乳酸菌噬菌體LP65。基于這些數據將Bc431v3作為Spounavirinae的一員;然而由于所有不同的分類信息已被處理很難確定屬。Bc431v3噬菌體包含一些高度不尋常的基因，如gp143編碼假定的tRNAHis鳥苷轉移酶。此外它攜帶的一些基因似乎與宿主的孢子調節有關。這些是gp098，它編碼與FstK/SpoIIIE DNA轉運蛋白相關的分離蛋白;gp105，一種推測的分離蛋白;gp108,RNA聚合酶sigma因子F/B;以及編碼RNA聚合酶西格瑪因子G的gp109。
圖1、已知有毒和無毒基因的混合物轉化效率的差異。柱狀圖顯示了兩個不同基因復制的樣品的CFU/ng值的平均值。
圖2、利用Biosense生長曲線分析儀測試分離的噬菌體宿主范圍。
圖3、使用全自動生長曲線法確定噬菌體Bc431v3裂相對的裂解尺寸與時間的關系。
圖4、Biosense生長曲線分析儀應用于測試不同菌株芽孢桿菌中添加噬菌體Bc431v3后的代表性微生物生長曲線圖，該噬菌體能夠完全抑制蠟樣芽孢桿菌LJH431的生長(完全裂解++）。而只延遲了B.cereus PAL 25的生長(部分裂解;+)。另一方面，c431v3既不能抑制也不能延遲枯草桿菌C1004的生長。蠟樣芽孢桿菌LJH431是指在沒有噬菌體Bc431v3的情況下，蠟樣芽孢桿菌LJH431的生長情況。
圖5、利用CGview制備噬菌體Bc431v3的遺傳和物理圖譜。Blast 1顯示了噬菌體Bc431v3蛋白與B.cereus噬菌體Bcp78蛋白的序列同源性。Blast 2顯示了噬菌體Bc341v3與李斯特菌噬菌體A511之間的序列同源性。裂解3顯示了序列之間的同源性噬菌體Bc431v3和噬菌體?EF24C腸球菌。在這些案例中，TBLASTX被用來在蛋白質水平上搜索序列相似性。
總結：因為很少有蠟樣芽孢桿菌噬菌體被分離出來并被詳細描述。因此研究人員對一些溫帶的蠟樣芽孢桿菌噬菌體進行了鑒定，并將其用于蠟樣芽孢桿菌的轉導分析。此外還有許多裂解性噬菌體已被分離出來，并用于流行病學研究的噬菌體分型方案。噬菌體分型被認為是一種有效的方法，特別是因為蠟樣芽胞桿菌、圖林根芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌之間有密切的親緣關系，為鑒定如此接近的物種提供了一種便宜、方便和相當準確的工具。研究人員提供了分離出一種大的、有毒的、廣泛的宿主范圍的蠟樣芽孢桿菌噬菌體vB_BceM_Bc431v3的數據(Bc431v3)。Bc431v3有一個158,618 bp的dsDNA基因組，包括239個假定的開放閱讀框(ORFs)和20個tRNA基因，它們編碼17種不同的氨基酸。研究人員為了確定噬菌體Bc431v3的基因組序列，并結合科學文獻和GenBank中現有的噬菌體對其基因進行注釋和結構功能鑒定。
采用了Biosense生長曲線分析儀的高通量測試技術測定宿主特異性，選定芽胞桿菌屬的菌株Bc431v3，利用Biosense生長曲線分析儀，通過儀器的高通量測試技術測量在液體介質的光密度(OD)來監測細菌噬菌體的存在。根據宿主特異性將噬菌體的生長曲線圖將所得的實驗分為三組:(++)即噬菌體完全抑制宿主菌生長時;(+)說明噬菌體延緩了宿主細菌的生長;（-）表明噬菌體對細菌的生長沒有影響。這也說明全自動生長曲線分析儀在鑒定噬菌體的相關性能方面具有很好的應用前景。
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