小反芻獸疫病毒生長曲線繪制及生長特性分析
將含高滴度小反芻獸疫病毒的新鮮病料研磨后接種VERO DS細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離，出現(xiàn)細(xì)胞病變后連續(xù)傳代，取3代以上培養(yǎng)物，進(jìn)行RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)及生長曲線測(cè)定。生長曲線測(cè)定分別以0.01和0.1 MOI接種VERO DS細(xì)胞，每隔12h測(cè)定病毒滴度，連續(xù)培養(yǎng)168h，繪制病毒生長曲線，分析生長特性。結(jié)果顯示，病料接種細(xì)胞72h后，出現(xiàn)細(xì)胞病變，經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定為小反芻獸疫病毒；生長特性研究顯示，0.01和0.1 MOI兩種病毒接種量，病毒滴度最高均為106 TCID50左右，但峰值出現(xiàn)時(shí)間和下降速度存在差異，0.01 MOI接種量出現(xiàn)峰值晚，但是維持高滴度時(shí)間較長。本文成功分離一株小反芻獸疫病毒，并對(duì)兩種接毒量的生長特性差異進(jìn)行了初步分析，為探索該病毒培養(yǎng)方法和收毒時(shí)間提供了借鑒。
小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）又稱小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎、口炎肺腸炎綜合征等，是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起，臨床以發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為主要特征的綿羊和山羊的一種急性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率最高可分別達(dá)到100%和90%[1，2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病，是《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》重點(diǎn)防控的13種外來動(dòng)物疫病之一。該病于1942年在非洲西部的象牙海岸科特迪瓦首次暴發(fā)，2007年[3]和2013年先后傳入我國西藏和新疆部分地區(qū)，并在其他多地出現(xiàn)PPR疫情。
PPRV與牛瘟病毒（RPV），犬瘟熱病毒（CDV）、海豹瘟病毒（PDV）、海豚瘟病毒（DDV）、牛麻疹病毒（MV—K1）和人麻疹病毒（MV）等同為副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbolivirus）成員[4]。基因組為單股負(fù)鏈、無節(jié)段RNA[5]。其RNA鏈從3'到5'端依次為編碼N-P-M-F-H-L蛋白的基因[5]。目前該病毒僅有一個(gè)血清型，從遺傳演化上，根據(jù)F基因分析可分為四個(gè)族系，IV系主要分布在中東和西亞，我國發(fā)生的PPR疫情也為IV系[3，6]。
本研究將患病羊的組織病料接種VERO DS細(xì)胞，分離出一株P(guān)PRV，經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)確認(rèn)后，對(duì)0.1和0.01 MOI病毒接種量的生長特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同接種劑量條件下，病毒具有不同的增殖曲線。本研究對(duì)于如何分離PPRV具有一定實(shí)踐意義，此外，還揭示了用VERO DS細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖時(shí)，接毒劑量與增殖、病毒活力之間的關(guān)系，為PPRV的培養(yǎng)提供了參考。
1、材料與方法
1.1主要儀器和試劑
Hettich MIKRO 220R低溫臺(tái)式離心機(jī)；Olympus倒置熒光顯微鏡；Heraeus CO2培養(yǎng)箱；杭州博日Gene Max PCR儀；Count Star細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；DMEM購自life公司；胎牛血清購自Hyclone公司；VERO DS細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；High pure viral RNA kit購自ROCHE公司；PPRV特異性單克隆抗體和VERO DS細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；PPRV常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法為本實(shí)驗(yàn)室建立。
1.2 VERO DS細(xì)胞的準(zhǔn)備
取生長狀態(tài)良好的VERO DS細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代，待細(xì)胞覆蓋細(xì)胞瓶底70%時(shí)，PBS洗2次，備用。
1.3病料采集與處理
采集發(fā)病期間死亡羊的脾臟，充分剪碎后加入10倍量的Hank's液，研磨器中研磨成乳劑，以3 000 r/min離心沉淀10 min后取上清液，0.2μm孔過濾除菌，備用。
1.4病料接種
將處理好的病料上清液按培養(yǎng)液體積的1/10接種VERO DS細(xì)胞系，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)吸附，1h后棄去上清，PBS洗2次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)未接病料對(duì)照，每天觀察細(xì)胞病變情況。
1.5病毒鑒定
1.5.1 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞出現(xiàn)病變后，連續(xù)傳三代，取第三代病毒液200μL，用ROCHE公司High pure viral RNA kit提取病毒RNA，并用PPRV特異性檢測(cè)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。
1.5.2免疫熒光檢測(cè)將病毒接種于長滿單層VERO DS細(xì)胞的96孔板，置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，待病變達(dá)60%～70%時(shí)，吸凈培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次，加入95%的甲醇固定10min。棄掉固定液，敞開培養(yǎng)板使其自然干燥。加0.5%Triton室溫作用15 min。用PBS將PPRV特異性單克隆抗體1:2 000稀釋后加入培養(yǎng)板，40μL/孔，37℃振搖孵育1 h。PBST洗滌三次，每孔加入40μL 1:100稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG，37℃振搖孵育1 h，PBST洗滌三次，加90%甘油50μL。熒光倒置顯微鏡下觀察。
1.5.3生長曲線測(cè)定測(cè)定第三代病毒液TCID50，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞濃度，分別以0.01 MOI和0.1 MOI[7]接種VERO DS細(xì)胞各14瓶，每隔12h取出1瓶-70℃凍存，用于檢測(cè)病毒滴度，連續(xù)培養(yǎng)7天。分別測(cè)定14瓶細(xì)胞的TCID50，繪制病毒生長曲線。
2、結(jié)果與分析
2.1病毒分離與CPE觀察結(jié)果
鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，接毒后第3天可見細(xì)胞發(fā)生融合，形成多個(gè)大小不等的合胞體（圖1）。第4天，病變細(xì)胞呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀，繼之出現(xiàn)大片脫落（圖2）。連續(xù)傳至第3代，每代可見相同的CPE。將該分離毒命名為PPRV-S。
2.2病毒的RT-PCR鑒定
用PPRV特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在300bp左右出現(xiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符，將擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工測(cè)序，核酸片段為PPRV特異性核酸片段（圖3）。
2.3免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
間接免疫熒光檢測(cè)顯示，在接種PPRV-S分離毒的細(xì)胞孔發(fā)現(xiàn)綠色熒光，陰性對(duì)照孔未發(fā)現(xiàn)綠色熒光（圖4），表明該分離毒可被PPRV特異性單克隆抗體識(shí)別。
圖1細(xì)胞融合形成合胞體
圖2細(xì)胞病變脫落呈拉網(wǎng)狀
圖3 PPRV的RT-PCR鑒定結(jié)果
圖4免疫熒光檢測(cè)（400×）
2.4 TCID50檢測(cè)結(jié)果
不同接毒時(shí)間TCID50的檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒接種細(xì)胞后病毒滴度首先出現(xiàn)一定程度下降，在12-24h病毒滴度最低，之后開始快速升高，36-60h達(dá)到峰值，兩種病毒接種量的最高TCID50為接近106TCID50/mL，之后緩慢下降。接毒168h后，病毒滴度仍能達(dá)到103-104TCID50/mL（圖5）。
不同病毒接種量TCID50檢測(cè)結(jié)果顯示，0.1 MOI接種量在接種后36h即可達(dá)到病毒滴度峰值，0.01 MOI接種量則在60h病毒滴度峰值。就出現(xiàn)后的下降速度而言，0.1 MOI接種量出現(xiàn)峰值后滴度迅速下降，84h后病毒滴度降低至104TCID50/mL以下，而0.01 MOI接種量出現(xiàn)峰值雖然較晚，但直至接毒132 h后病毒滴度才下降至104TCID50/mL以下；兩者在接毒168h后，病毒滴度基本相同，為103.5TCID50/mL左右（圖5）。
圖5 PPRV-S的TCID50變化曲線
3、討論
PPRV是一種有囊膜的單股RNA病毒，在2007年首次傳入我國西藏，時(shí)隔6年又傳入我國新疆地區(qū)。據(jù)OIE網(wǎng)站提供資料，除新疆外，該病2014年在我國多個(gè)省、市、自治區(qū)相繼發(fā)生，防控形勢(shì)極為嚴(yán)峻。多角度研究PPRV相關(guān)特性，為PPR防控提供技術(shù)支持很有意義。
目前用于分離病毒的細(xì)胞為VERO細(xì)胞系和VERO DS細(xì)胞系。研究發(fā)現(xiàn)，病毒在感染細(xì)胞的過程中，SLAM蛋白是介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要受體，促使病毒囊膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，進(jìn)而使病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[8]。VERO DS細(xì)胞系因在細(xì)胞表面存在犬SLAM受體，提高了病毒的分離效率，因此理論上說，VERO DS細(xì)胞系比VERO細(xì)胞系更適合用于PPRV分離，但是由于羊和犬的SLAM蛋白同源性不到70%，所以VERO DS細(xì)胞系仍不是用于PPRV分離的最佳細(xì)胞。由于本實(shí)驗(yàn)室沒有細(xì)胞表面存在的羊SLAM蛋白的細(xì)胞系，所以用VERO DS細(xì)胞進(jìn)行PPRV分離。
由于PPRV對(duì)環(huán)境的抵抗力非常弱，50℃60分鐘即可被滅活，陽光照射也容易將病毒滅活[7，9]。現(xiàn)實(shí)工作中，從對(duì)發(fā)病羊采集樣品到運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離往往需要幾天甚至更長時(shí)間，這時(shí)的樣品雖然用RT-PCR仍能檢測(cè)出高含量的病毒核酸，但病毒往往已經(jīng)不具有感染性，不適合進(jìn)行病毒分離。因此，一旦確定采樣的目的是分離病毒，需要在采集樣品后及時(shí)冷凍保存并盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離，避免反復(fù)凍融和在室溫下放置太長時(shí)間。此外，運(yùn)輸過程中也要保持低溫。同時(shí)，還需要盡量選擇病毒含量高的組織樣品用于病毒分離，以提高分離效率。但需要注意的是，由于腸組織中含有大量的酶類成份，容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，不太適合用于病毒分離。
本研究除分離到一株P(guān)PRV外，還繪制了分離毒的生長曲線。通過對(duì)接毒后168h的觀察發(fā)現(xiàn)，病毒接種后24h內(nèi)，病毒滴度出現(xiàn)下降，可能由于病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但還未產(chǎn)生具有感染性的新的病毒。24h至36h是病毒的對(duì)數(shù)繁殖期，這一時(shí)期有大量的新病毒被釋放出來，之后病毒滴度開始出現(xiàn)緩慢降低或維持一定水平。本文采用了兩個(gè)病毒接毒劑量，0.1MOI和0.01MOI，其中0.1MOI孔出現(xiàn)病毒滴度峰值的時(shí)間明顯早于0.01MOI組，但之后迅速下降。而0.01MOI組雖然出現(xiàn)峰值的時(shí)間明顯晚于0.1MOI組，但卻略高于0.1MOI組，而且能夠在較高的滴度維持較長的時(shí)間。兩種接毒劑量在168h均有一定的感染力。這一研究對(duì)于PPR疫苗研究和生產(chǎn)過程中何時(shí)收獲病毒液有一定借鑒意義。由于目前我國使用的PPR疫苗為弱毒疫苗，因此如何保證生產(chǎn)過程中活毒效價(jià)非常重要。考慮到實(shí)際生產(chǎn)過程中無法對(duì)每個(gè)批次進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的TCID50測(cè)定，作者建議采用能使病毒在高滴度維持較長時(shí)間的0.01MOI接種劑量。需要說明的是，本文只研究了PPRV在VERO DS細(xì)胞系上的生長曲線，如果了解在VERO細(xì)胞上的生長特性，還需要另外進(jìn)行相關(guān)研究。
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