納米材料Cu2-xSe NCs可在1 h內殺死所有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌、革蘭氏陽性菌
2結果與討論
2.1硒化銅納米晶體的表征
用水熱法合成的Cu2-xSe NCs分散均勻且粒徑均一，約為12.8 nm，因其獨特的銅缺陷結構而在近紅外區具有強烈的局域表面等離子體共振吸收。此外，由于所用包被劑為CTAB，所以該Cu2-xSe NCs表面帶正電。Cu2-xSe NCs的表征結果見圖2。
圖2 Cu2-xSe NCs的表征。(A)Cu2-xSe NCs的透射電鏡(TEM)圖像;(B)Cu2-xSe NCs的粒度分布，其通過在視野中隨意計數100個顆粒而獲得;(C)Cu2-xSe NCs的UV-Vis吸收光譜；(D)Cu2-xSe NCs和H2O的Zeta電位
2.2硒化銅納米晶體對常見致病菌的抗菌活性
本實驗從Cu2-xSe NCs對E.coli和S.aureus的細菌存活率、MIC和MBC三個方面考察其抗菌活性。如圖3所示，隨著Cu2-xSe NCs濃度的增加，無論是E.coli還是S.aureus，其細菌存活率都逐漸下降。此外，Cu2-xSe NCs對S.aureus的影響明顯強于對E.coli的影響。對于E.coli，當Cu2-xSe NCs的濃度為32μg/mL時，細菌存活率為0，即無細菌生長，而對于S.aureus，只需4μg/mL的Cu2-xSe NCs已可以抑制其生長。Cu2-xSe NCs對常見致病菌的MIC測定進一步證實了上述結論。因MIC是指引起細菌肉眼觀察下未見生長的藥物最低濃度，故我們選擇肉眼可見細菌培養液澄清透明的EP管對應的Cu2-xSe NCs濃度為該材料的MIC。如圖4所示，Cu2-xSe NCs對E.coli的MIC為32μg/mL，對S.aureus的MIC為4μg/mL。這一現象也和其細菌存活率結果一致。
圖3 Cu2-xSe NCs對E.coli(A)和S.aureus(B)細菌存活率的影響
圖4 Cu2-xSe NCs對常見致病菌的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)
以MIC為界，將MIC及其后未長菌試管和MIC的前一個試管中的培養液取200μL轉移到干凈的固體LB培養基上，涂板并在37℃全溫搖床中孵育12 h，觀察細菌生長情況，結果見圖5。對于E.coli，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC為32μg/mL，而對于S.aureus，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC則為4μg/mL。
圖5 Cu2-xSe NCs對常見致病菌的MBC
2.3硒化銅納米晶體對耐藥菌株的抗菌活性
圖6 Cu2-xSe NCs對E.coli耐藥菌株(A)和S.aureus耐藥菌株(B)細菌存活率的影響
考察了Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的抗菌活性，其內容為Cu2-xSe NCs對E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株的細菌存活率、MIC和MBC三個方面。如圖6所示，Cu2-xSe NCs對耐藥菌株細菌存活率的影響和對其普通菌株的影響相似，對于E.coli耐藥菌株，當Cu2-xSe NCs濃度為32μg/mL時，細菌存活率為0，而對于S.aureus耐藥菌株，只需4μg/mL Cu2-xSe NCs。
Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的MIC也和對其普通菌株的MIC一致，對于E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株，MIC分別為32μg/mL和4μg/mL(圖7)。而Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的最小殺菌濃度MBC則不太相同(圖8)。對于E.coli耐藥菌株，Cu2-xSe NCs的MBC為32μg/mL，對于S.aureus耐藥菌株，Cu2-xSe NCs的MBC為8μg/mL，和Cu2-xSe NCs對S.aureus普通菌株的MBC 4μg/mL相比，略高。
圖7 Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)
圖8 Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的MBC
2.4硒化銅納米晶體的抑菌動力學
為了探究Cu2-xSe NCs對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的的抑菌動力學，我們測定了細菌生長曲線和時間-殺菌曲線。如圖9所示，對于E.coli，細菌在孵育2 h后開始進入對數生長期，直至12 h后進入平臺期。隨著Cu2-xSe NCs濃度的逐漸增加，雖然細菌的生長趨勢并未改變，但是增長速度逐漸減小，當其濃度為16μg/mL時，細菌在孵育8 h后才進入對數生長期并于12 h后進入平臺期；而當Cu2-xSe NCs濃度增加到32μg/mL時，即達到MIC時，細菌不再生長。對于S.aureus，細菌在孵育1 h后就開始進入對數生長期，12 h后進入平臺期。并且S.aureus受Cu2-xSe NCs濃度影響更大，隨著其濃度的逐漸增加，細菌的增長速度大幅降低。當Cu2-xSe NCs濃度到達MIC時，細菌基本不生長。再一次證明了S.aureus對Cu2-xSe NCs更敏感。
圖9 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的生長曲線
時間-殺菌曲線可以評估一種抗菌藥物對細菌的殺菌速率。我們取Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC進行實驗(圖10)。對于E.coli，當Cu2-xSe NCs濃度為0或者0.5倍MIC時，細菌數目持續增長，但當其濃度到達32μg/mL，即Cu2-xSe NCs對E.coli最小殺菌濃度MBC時，細菌在1 h內全部死亡。對于S.aureus，當Cu2-xSe NCs濃度為0時，細菌不斷生長，但隨著其濃度的增加，細菌逐漸減少，當其到達Cu2-xSe NCs對S.aureus最小殺菌濃度的MBC(4μg/mL)時，細菌在8 h內全部死亡。伴隨著Cu2-xSe NCs濃度的不斷增大，細菌死亡時間愈來愈短，當其為32μg/mL時，細菌在1 h內全部死亡。即，當Cu2-xSe NCs濃度為32μg/mL時，不管是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌，都會在1 h內全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強的殺菌性能。
圖10 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的時間-殺菌曲線
圖11 Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線
2.5硒化銅納米晶體的抗菌機制
在抗菌劑抗菌機制研究中，較為公認的有四種途徑：其一，金屬離子接觸反應，這也是無機抗菌劑最普遍的抗菌作用機理；其二，催化激活機理，即通過催化產生活性氧物質從而殺死細菌；其三，陽離子固定機理，即抗菌劑攜帶陽離子基團，以此固定負電荷的細菌，從而使其接觸性死亡并破壞細胞壁和細胞膜；其四，細胞內容物、酶、蛋白質、核酸損壞機理，這是許多有機抗菌劑的抗菌機理。為考察Cu2-xSe NCs的抗菌機制，我們首先測定Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線(圖11)，不斷增加的Cu2+濃度證明了Cu2-xSe NCs可以持續釋放Cu2+，從而實現持久抗菌的作用。其次，我們使用了活性氧(ROS)熒光探針DCFH-DA，并通過熒光共聚焦分析Cu2-xSe NCs與細菌作用是否有活性氧物質的產生，通過實驗我們發現Cu2-xSe NCs并不會產生ROS，即不是通過催化激活機理殺死細菌。Zeta電位(圖2D)證實Cu2-xSe NCs因其包被劑為CTAB，一種帶季胺鹽基團的陽離子表面活性劑而帶正電，證明Cu2-xSe NCs可通過陽離子固定機理實現殺菌。最后我們考察了細胞內容物、酶、蛋白質、核酸損壞機理，實驗結果證明Cu2-xSe NCs并不能通過該途徑滅菌。
綜上所述，Cu2-xSe NCs的殺菌性能主要依靠金屬離子接觸反應和陽離子固定機理實現。
3結論
本實驗研究發現，Cu2-xSe NCs擁有較強的殺菌性能，對常見的E.coli(革蘭氏陰性菌)和S.aureus(革蘭氏陽性菌)表現出殺菌活性，并且對其耐藥菌株具有良好抑菌能力，而S.aureus對Cu2-xSe NCs更為敏感，這是由于E.coli具有雙層膜而S.aureus僅擁有單層膜。此外，當Cu2-xSe NCs濃度為32μg/mL時，不管是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌，都會在1 h內全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強的殺菌性能。因此，在新型抗菌藥的研究中，納米材料Cu2-xSe NCs具有成為新型抗菌劑的潛力。