MDCK單克隆細胞復蘇活率、生長狀態、生長速度和生長形態研究
MDCK細胞(犬腎細胞，Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)系是1958年由Madin等從美國的一頭Cocker Spanie母曲架犬的腎臟組織中分離得到的[1]。MDCK細胞呈上皮細胞樣，容易培養、增殖快、貼壁生長，也可馴化為懸浮培養，可連續傳代[2].大量研究表明，MDCK細胞對多種不同亞型的流感病毒株敏感.病毒用MDCK細胞培養的產量高等特點，可以用來代替雞胚用于疫苗的生產[3-6]。MDCK單克隆細胞是本實驗室由MDCK工作庫細胞通過有限稀釋法所制備，共制備114株.不同的MDCK單克隆細胞株在生長特性上有較大的差異.
本研究前期通過有限稀釋法將MDCK細胞進行單克隆化，獲得了自建MDCK單克隆細胞庫，庫內共有114株單克隆細胞.現通過復蘇MDCK單克隆細胞，統計細胞復蘇活率、生長狀態、生長速度和生長形態等特性，確定MDCK單克隆細胞庫的可用性，旨在為后期篩選病毒敏感的MDCK單克隆細胞實驗提供資源和理論參考，為流感疫苗的生產提供參考.
1材料和方法
1.1 MDCK單克隆細胞
MDCK單克隆細胞由本實驗利用MDCK工作庫細胞(MDCK-W-63)通過有限稀釋法篩選獲得，共114株.
1.2主要試劑
DMEM培養基、0.25%胰酶和PBS(蘭州百靈生物技術有限公司)；胎牛血清(蘭州民海生物有限公司)；臺盼藍(廣州展晨生物科技有限公司).
1.3主要儀器設備
CO2細胞恒溫培養箱(上海博訊公司)、生物倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學科技有限公司)、潔凈操作臺(蘇州凈化設備有限公司).
1.4細胞培養
將儲存于液氮罐中的MDCK單克隆細胞取出，在37℃水中快速融化后置于50 cm2培養瓶中，補加培養基(DMEM+10%胎牛血清)，再置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養.待MDCK細胞生長至致密單層時，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，緩慢搖動細胞培養瓶，使胰酶充分沒過細胞表面，將細胞放回培養箱內繼續消化5 min取出，在顯微鏡下觀察.當細胞全部變圓并開始脫落時棄去胰酶，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續放置3 min后取出，并倒去胰酶加入15 mL DMEM培養基.將細胞吹打混勻后按1∶4比例傳代，將細胞繼續放入37℃、5%CO2的培養箱中培養.
1.5細胞復蘇活率
待細胞復蘇后，將細胞懸液50 uL加入PE管中，加入50uL 0.5%臺盼藍染液，染色2～3 min.吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片，鏡下取任意視野細胞計數.死細胞能被臺盼藍染上色，鏡下可見深藍色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀.細胞活率=(未著色細胞數/總細胞)×100%.
1.6細胞生長速度、狀態
如1.4中所述進行細胞復蘇并培養至單層致密，將細胞密度調整為5×104個/mL傳代細胞.將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，每天觀察細胞兩次.統計MDCK單克隆細胞長滿需要的時間，以評價細胞生長速度.通過觀察細胞的邊緣清晰程度、整齊程度與大小差異來評價細胞生長狀態.
1.7細胞的生長形態
如1.4中所述復蘇細胞，將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，每天觀察細胞兩次.觀察細胞復蘇貼壁后細胞的生長形態并統計細胞生長形態的種類.
2結果
2.1 MDCK單克隆細胞的復蘇活率
MDCK單克隆細胞庫內114株MDCK單克隆細胞株復蘇后，細胞最低活率為92.1%，最高活率為97.3%，平均活力為0.954±0.016，高于制備MDCK單克隆細胞所使用的工作庫細胞.
2.2 MDCK單克隆細胞的生長狀態和速度
MDCK單克隆細胞庫內114株細胞，2 d長滿的細胞株為70株，占61.4%；3 d長滿的35株，占30.7%；4 d長滿5株，占4.4%；超過4 d長滿的4株，占3.5%.細胞生長狀態良好的細胞有66株，占57.9%,一般的細胞有43株，占37.7%；較差的細胞共有5株，占4.4%.
表1 MDCK單克隆細胞生長速度和狀態統計表
2.3 MDCK單克隆細胞形態分析
MDCK單克隆細胞共有3種細胞形態，第一類為典型的多角上皮樣細胞形態，與MDCK母細胞形態一致，長滿單層后呈規則石塊狀鋪展生長，貼壁迅速.高倍鏡下細胞胞質豐滿，核仁清晰，如圖1A所示.第二類為梭形成纖維狀細胞形態，與MDCK母細胞的形態差異較大，細胞呈梭形、長條形、不規則形，呈相互平行排列，細胞呈現成群放射狀、漩渦狀等形態，長滿匯合至100%時細胞呈細枝狀交錯生長，如圖1B所示.第三類為島狀樣細胞生長形態，與MDCK母細胞形態的差異更大.細胞單個貼壁，相互分散生長，一般不連成片、形成集落.相鄰單個細胞生長擁擠，細胞形成島狀樣生長，如圖1C所示.114株MDCK單克隆細胞的具體形態分布見表2，MDCK單克隆細胞中多角上皮樣細胞形態細胞有78株，占68%；成纖維樣細胞有13株，占12%；島狀樣細胞有23株，占20%.
表2 MDCK單克隆細胞形態表
A.多角上皮樣細胞(×100)；B.梭形成纖維樣細胞(×100)；C.島狀樣細胞(×100)
3討論
流感對人類健康威脅嚴重，及時接種疫苗是預防流感最有效的方法[7].目前，獲準生產人用流感疫苗的細胞系主要有Vero細胞和MDCK細胞[8].近年來使用MDCK單克隆細胞生產流感疫苗獲得很大發展[9].有限稀釋法是制備MDCK單克隆細胞經濟有效的方法，其通過細胞稀釋至每孔只有單個細胞后進行培養而獲得單克隆化細胞株，所制備的MDCK單克隆細胞株在生長特性上有較大差異.基于此，通過復蘇MDCK單克隆細胞株，統計所有細胞的生長速度、生長狀態以及細胞形態類型及其數量，確定制備的MDCK單克隆細胞庫的可用性.
MDCK細胞作為生產流感疫苗的基質，其培養好壞直接影響著流感病毒的篩選[10].細胞生長好壞可通過細胞的活率、生長狀態、生長速度、生長形態來綜合評價，活率高、狀態好、速度快、形態均一的細胞更適用于科學研究.細胞復蘇后經過培養可以修復損傷的細胞膜功能[11]，細胞活率在復蘇培養過程中可以得到顯著提高.本實驗室自建MDCK單克隆細胞庫細胞平均復蘇活率達0.954±0.016%，與細胞凍存前后活率差異不大，但比MDCK母細胞活率高.細胞的生長速度是提高實驗效率的重要條件，實驗周期是研究人員要密切關注的問題.生長速度的提高可以縮短實驗周期，篩選生長速度快的細胞就顯得尤為重要.MDCK單克隆細胞庫中大多數細胞均可在2～3 d長滿，有利于實驗快速有效地開展，縮短了實驗周期.細胞的生長狀態也是影響實驗成功與否的重要因素，生長狀態好的細胞更加有利于得到理想的實驗結果，MDCK單克隆細胞庫中生長狀態良好的細胞占比為57.9%，可為實驗提供可靠的細胞資源.細胞形態的多樣性可以用來評價MDCK單克隆細胞庫細胞的豐富性.本研究中MDCK單克隆細胞具有三種細胞形態.
前期實驗自制的MDCK單克隆細胞庫內細胞復蘇活率高，生長速度快，狀態良好，庫內細胞有三種形態，可為后續甲型H1N1流感病毒篩選實驗提供敏感細胞基質，為篩選提供豐富的資源，并為流感疫苗的生產參考依據.