超聲波處理對谷氨酸棒狀桿菌生長、形態、通透性的影響
為了提高菌株發酵的產量、質量以及安全性，我們提出了多種工藝強化的方法。在這里報道其中的一種，在分批補料發酵的同時，應用超聲波對發酵液進行處理從而來提高谷氨酸棒狀桿菌生產L-亮氨酸的能力。進一步采用響應面法對超聲條件進行優化。在超聲功率密度為94 W/L、頻率為25kHz、間隔31min、持續時間為37s的條件下，谷氨酸棒狀桿菌在44h生產了52.89g/L的L-亮氨酸，較對照組增加21.6%。超聲波處理提高了L-亮氨酸的生產性能。此外，從細胞形態、細胞膜透性和酶活性等方面研究了超聲波處理對L-亮氨酸發酵性能的影響。結果表明，超聲波處理對于谷氨酸棒狀桿菌生產L-亮氨酸是有效的。
研究內容
1.不同生長期超聲處理對谷氨酸棒狀桿菌生物量的影響
谷氨酸棒狀桿菌的生長曲線如圖a所示，作為識別不同生長期的基線數據。培養前4h為延滯期，培養后4h至20h為指數期，培養20h后進入穩定期。在進行發酵的同時應用超聲波對發酵液進行處理，超聲波處理時長分別為2、4、8、16、20和24h，超聲波處理對谷氨酸棒狀桿菌不同生長階段的影響如圖b所示。在滯后期和指數期開始時，生物量顯著增加，在8h時，超聲波處理的谷氨酸棒狀桿菌的生長比對照增加了15.6%。超聲處理在指數后期和穩定期會導致生物量顯著下降。超聲波對微生物有雙重作用：對細胞生長的積極影響是可以提高酶的活性和營養物質的傳質速率，而消極影響是應用超聲波所產生的剪切力和自由基。不同生長階段的細胞對超聲波的耐受性不同。因此，后續實驗選擇以8h為指標進行超聲處理。
2.超聲參數對谷氨酸棒狀桿菌生長的影響
不同功率和頻率的超聲在液體介質中產生穩定或瞬態的液體空化。瞬態空化發生在20-100 kHz的低頻處，而超過200kHz的高頻會導致穩定的空化，在高、低聲壓之間產生數千個振蕩周期。為提高谷氨酸棒狀桿菌的生物量積累，進行了單因素試驗，研究了不同超聲處理參數對谷氨酸棒狀桿菌生長的影響。結果表明，在28kHz、100W/L的脈沖作用0.5h后，開、關時間分別為100s和10s時，肽含量和活細胞數量的增幅最大。
3.采用響應面分析法優化超聲處理條件
在本研究中，通過回歸分析發現四個自變量對超聲處理下L-亮氨酸產量的影響呈線性關系。L-亮氨酸受超聲功率密度、頻率、間隔和持續時間(所有case的P<0.01)影響。功率密度與頻率、功率密度與間隔、頻率與間隔的交互作用具有統計學意義（P<0.05）；而功率密度與持續時間、頻率與持續時間、間隔與持續時間的交互作用不顯著（P>0.05）。
結果利用超聲功率密度為94.00W/L、頻率為25.47kHz、間隔時間為31.13min、持續時間為37.04s的預測剖面模型得到了L-亮氨酸生產的最佳條件。在最佳超聲處理條件下，L-亮氨酸的最大預測效價為53.36g/L。最終預測值與實驗值之間的誤差小于2%。
4.超聲波處理對谷氨酸棒狀桿菌細胞形態的影響
掃描電鏡廣泛用于評價微生物的表面特征、形態和超微結構。通過掃描電鏡觀察了超聲處理對細胞形態的影響。谷氨酸棒狀桿菌細胞呈典型的不對稱桿狀，但超聲培養的谷氨酸棒狀桿菌細胞較對照組呈現出不規則、細長以及腫脹。
5.超聲波處理對細胞通透性的影響
為了確定超聲處理是否影響谷氨酸棒狀桿菌細胞膜的完整性，我們結合熒光顯微鏡使用了活性染色來進行觀察。應用PI和SYTO9雙染時，細胞膜完整的細胞顯示綠色熒光，而受損的細胞膜允許PI流入，導致呈現紅色熒光。如圖所示，與未處理的對照組相比，超聲下發出綠色熒光的細胞數量減少，而發出紅色熒光的細胞數量增加。這說明超聲波處理對谷氨酸棒狀桿菌的細胞膜造成了一定程度的損傷。膜通透性的增加也會導致L-亮氨酸的胞內外排，從而減緩L-亮氨酸生物合成途徑中關鍵基因的轉錄衰減和關鍵酶的反饋抑制。這是超聲提高L-亮氨酸產量的原因之一。此外，穩定的微泡振蕩還會導致H2O2和其其他活性氧的產生，進一步使脂質和膜蛋白過氧化。脂質和膜蛋白過氧化可能是膜通透性增加的原因之一。膜滲透性增強的另一個可能原因是空化，這直接導致了超聲處理產生的力學效應。超聲在物理和化學層面上都能增加細胞膜的通透性。
谷氨酸棒狀桿菌最新研究進展
近期，在最近發表于《先進材料》（Advanced Materials）的論文中，研究人員發現了一種新的方法可以治療因佩戴隱形眼鏡而引起的干眼癥，即在隱形眼鏡中加入能夠分泌潤滑物質的細菌。
市面上有許多隱形眼鏡中都添加了透明質酸，相比于眼藥水，它們能更持久地緩解干眼癥。德爾·坎波表示，眼藥水的作用只能保持幾分鐘。
然而，含有透明質酸的鏡片仍然不足以徹底解決這個問題。德爾·坎波指出，為了不影響隱形眼鏡鏡片的光學性能，廠家只能在其中添加少量的透明質酸，因此緩解效果最多只能維持幾個小時。之后，使用者可能仍然需要眼藥水。
能夠分泌透明質酸的細菌可以補充透明質酸，或能為這個問題提供了解決方案。“細菌分泌的潤滑劑會擴散到隱形眼鏡的表面。”德爾·坎波說，“盡管淚液會不斷清除潤滑劑，但是隱形眼鏡表面具有自我更新功能，可以提供永久的潤滑作用。”這樣使用者就不再需要滴眼藥水，且可以較為舒適地配戴隱形眼鏡更長時間。
研究中使用的是谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum），這是一種天然存在于土壤的、無害的細菌，不會產生毒素。美國食品藥品監督管理局（FDA）也認可對于人體來說，它是一種安全的細菌。
長期以來，谷氨酸棒狀桿菌因合成氨基酸的能力而受到廣泛關注。在工業領域，谷氨酸棒狀桿菌用于合成生產食品調味料、防曬霜等一系列產品的原料。它也經過生物工程改造后，用于生產醫療和制藥行業所需的氨基酸。德爾·坎波說："它是生物技術生產中的主力軍”。
研究人員在這項研究中選擇谷氨酸棒狀桿菌不僅因為它可以通過生物工程改造分泌透明質酸，還因為它和另一種棒狀桿菌Corynebacterium mastitidis的親緣關系很近，而后一種棒狀桿菌是一種天然存在于人眼中的益生菌。
目前，市面上的隱形眼鏡只能提供少量的透明質酸用來潤滑，而谷氨酸棒狀桿菌只要可以獲得營養物質，就能不斷制造透明質酸。