基于食淀粉乳桿菌的生長曲線制備菌株胞外囊泡，且不破壞囊泡結構
目前，對食淀粉乳桿菌胞外囊泡及其提取方法的研究和開發尚處于空白階段。如何獲得一種高效、高純度、低成本的食淀粉乳桿菌胞外囊泡制備方法且在制備過程中不破壞囊泡結構是目前急需解決的。
為了克服現有技術中存在的至少一個問題，從低成本、高效、高純度等方面出發綜合優化，以食淀粉乳桿菌的生長曲線為切入點，以特定培養時間擴大菌體產量，結合超濾法濾過小分子蛋白等雜質，再以超速離心法分離出胞外囊泡，從而獲得高濃度的菌源胞外囊泡。下面提供了一種高效、高純度、低成本地快速提取食淀粉乳桿菌胞外囊泡(LaEVs)且不會破壞囊泡結構的方法，且證明由食淀粉乳桿菌分泌的胞外囊泡具有效濃度，且形態結構完好無損。
為實現上述目的，建議采用如下技術方案：
一種食淀粉乳桿菌胞外囊泡的制備步驟：
1、接種食淀粉乳桿菌進行培養，獲得含胞外囊泡的發酵菌液；
復蘇菌種后，挑取菌種于培養基中，放置于恒溫培養箱37℃培養4～8h后，以1～4wt％的接種量接種于1～3L培養基中37℃培養12～24h。優選，復蘇菌種后，挑取菌種于MRS肉湯，放置于恒溫培養箱37℃培養6h后，以2wt％接種量接種于2L的MRS肉湯37℃培養18h，當其他條件保持一致，若降低發酵液體積，則胞外囊泡的產量會降低。上述步驟中，接種量與培養時間結合食淀粉乳桿菌的生長曲線，從而確定：2wt％為最佳接種量，6h為生長期對數前期，18h為生長期對數后期，按此步驟與條件培養，食淀粉乳桿菌的菌體活性與濃度較高，可最大程度提升其分泌的胞外囊泡產量。
2、將獲得的發酵菌液離心，去除菌體沉淀，將收集的上清液過濾，收集濾液；
具體包括：將發酵菌液以4000～6000g、4℃離心10～20分鐘，棄去菌體沉淀，將收集的上清液使用0.2～0.3μm過濾器過濾，收集濾液。優選，將發酵菌液以5000g、4℃離心15分鐘，棄去菌體沉淀，此時所得上清液體積高，保證了胞外囊泡的高產量；將收集的上清液使用0.22μm過濾器過濾，收集濾液，此過濾步驟進一步去除菌體沉淀與相似質量的物質，有利于可提升超濾效率，降低濾膜堵塞造成的損耗。
3、將獲得的濾液使用高級離心管離心，收集超濾液；
具體包括：將濾液使用超濾管4000～6000g、4℃離心15～60分鐘，收集超濾液。優選，將濾液使用超濾管5000g，4℃離心30分鐘。
超濾管含有可截留大于100kDa囊泡的超濾膜。此時超濾膜可截留大于100kDa的囊泡于超濾液中，小于100kDa的物質例如小型肽、寡核苷酸、核酸、酶等其他相似大分子將被除去，經過超濾步驟，可有效提升制備純度。
超濾管包括濾液接收器，濾液接收器內置樣本池，樣本池內固定封裝膜(超濾膜)，濾液接收器的頂部與樣本池蓋進行可拆卸連接。
超濾管為高級離心管。可理解的是，超濾管的型號及其過濾器的容積均可根據具體需要選擇。在一具體實施方式中，超濾管的過濾器的容積為15mL。利用超濾管濃縮含有胞外囊泡的液體中的胞外囊泡的離心力可為5000g。利用超濾管濃縮含有胞外囊泡的液體中的胞外囊泡的離心時間可為15-60分鐘。利用超濾管濃縮含有胞外囊泡的液體中的胞外囊泡在4℃下進行。
4、將獲得的超濾液超速離心，將得到的沉淀重懸、過濾，獲得食淀粉乳桿菌胞外囊泡。
具體包括：將超濾液以11000～160000g、4℃超速離心1～3小時；將得到的沉淀用PBS重懸，使用0.2～0.3μm過濾器過濾，獲得食淀粉乳桿菌胞外囊泡。優選，將超濾液以160000g，4℃超速離心2小時，此時質量相對較重的胞外囊泡將被沉淀，其他條件保持一致，降低超速離心轉速可導致胞外囊泡產量降低；將得到的沉淀用PBS重懸，使用0.22μm過濾器過濾，去除上述過程中可能存在的菌體污染，提高分離制備試驗的成功率。
食淀粉乳桿菌的分類命名為Lactobacillus amylovorus，其保藏編號為CCTCC NO：M2023427，保藏日期為2023年3月28日，保藏單位為中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏單位地址為中國，武漢，武漢大學。
本次以食淀粉乳桿菌的生長曲線為切入點，以特定培養時間擴大菌體產量，結合超濾法濾過小分子蛋白等雜質，再以超速離心法分離出胞外囊泡，從而獲得高濃度的菌源胞外囊泡，提供了一種高效、高純度、低成本的胞外囊泡制備方法，且不會破壞囊泡結構。此制備的食淀粉乳桿菌胞外囊泡在疾病治療、抗菌藥物靶點及藥物開發、工業發酵乳酸菌調控與動物保健等領域均具有潛在應用價值。
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