生長延滯期是什么意思？微生物生長延滯期檢測方法
食源性疾病是全球最重要的公共衛(wèi)生問題之一，引發(fā)食源性疾病的物質(zhì)包括病原微生物、寄生蟲、天然毒素以及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)等，其中由食源性致病菌引起的食源性疾病是全球食品安全面臨的最重要挑戰(zhàn)之一。近20年來，國內(nèi)對食源性致病菌的關(guān)注度持續(xù)上升，關(guān)于中國食品中食源性致病菌的檢出情況也有較多報道。2000—2014年，我國暴發(fā)的食源性疾病中一半以上是因為食用致病菌污染的食品而引起的。相較于物理及化學(xué)污染物，食源性致病菌引發(fā)的食品安全事件暴發(fā)率更高。針對此類食品安全問題，在食品工業(yè)中應(yīng)采取更有效的措施來控制食品中致病菌的污染水平，并估算其在不同食品加工及流通條件下的生長參數(shù)，以降低因食源性致病菌引發(fā)的食源性疾病暴發(fā)風(fēng)險。
在食源性致病菌的生長預(yù)測研究中，生長延滯期與最大比生長速率是兩個重要的生長參數(shù)。相較于最大比生長速率，生長延滯期更難定義和準(zhǔn)確預(yù)測，且微生物群體與單細(xì)胞水平下的生長延滯期概念與測定方法也并不相同。因此，為更加準(zhǔn)確地預(yù)測生長延滯期，研究影響其變化的相關(guān)因素至關(guān)重要。此外，通過基于實驗的觀測結(jié)果結(jié)合預(yù)測微生物學(xué)模型來計算生長延滯期的方法已被廣泛研究，而對生長延滯期中胞內(nèi)相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化及其對食源性致病菌生長的影響研究鮮少，研究相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化有利于從機(jī)理出發(fā)進(jìn)一步準(zhǔn)確地描述生長延滯期，并且有助于評估模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此值得深入探討。
目前，如何準(zhǔn)確預(yù)測食源性致病菌生長延滯期已成為食品安全風(fēng)險評估相關(guān)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。本文首先對生長延滯期的檢測方法進(jìn)行歸整和分析，并重點(diǎn)介紹生長延滯期的影響因素及可作為生長延滯期生理標(biāo)記的相關(guān)胞內(nèi)活動，最后對生長延滯期研究的發(fā)展趨勢提出建議，以期對食源性致病菌的相關(guān)風(fēng)險管理控制提供一定的理論支持。
1、生長延滯期
生長延滯期在生物學(xué)上被普遍接受的定義為：微生物群體適應(yīng)新環(huán)境的時間。延滯期之后細(xì)胞群體將開始分裂繁殖；而在微生物典型的S型生長曲線中，生長延滯期的幾何定義為：微生物對數(shù)生長期達(dá)到最大比生長速率時，生長曲線切線的反向延長線和初始菌量水平延長線的交點(diǎn)在時間軸上的投影點(diǎn)與零時刻的時間間隔。這也是目前預(yù)測微生物學(xué)建模中計算生長延滯期最常用的方法。微生物單細(xì)胞生長延滯期指的是單個細(xì)胞到達(dá)第一次分裂所需的時間，該時間段包括損傷修復(fù)及合成某種必需分子激發(fā)分裂的時間。無論是食源性致病菌的群體還是單細(xì)胞，對其生長延滯期的控制均有利于降低食品安全風(fēng)險，數(shù)學(xué)模型預(yù)測致病菌生長的準(zhǔn)確性很大程度上也取決于該模型對延滯期的預(yù)測能力，因此更好地理解生長延滯期并將其涉及的生理學(xué)知識納入預(yù)測微生物學(xué)模型中，對該模型在食品安全與質(zhì)量管理中的有效應(yīng)用具有重要意義。由于目前關(guān)于生長延滯期過程中涉及的相關(guān)生理過程（如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等角度）并未完全了解，并且微生物的本質(zhì)屬性及環(huán)境作用共同決定了細(xì)胞個體的生理狀態(tài)，因此需從機(jī)理角度出發(fā)進(jìn)一步準(zhǔn)確地定義生長延滯期。
2生長延滯期的檢測方法
目前微生物生長延滯期是通過建立生長曲線并結(jié)合預(yù)測微生物學(xué)模型計算獲得，而生長曲線的獲取需要足夠多且有效的數(shù)據(jù)點(diǎn)，因此生長延滯期的測定方法依賴于微生物細(xì)胞的定量方法。傳統(tǒng)的平板計數(shù)法是獲取微生物群體生長數(shù)據(jù)的最主要手段，而此法耗時較長，會導(dǎo)致數(shù)據(jù)無法實時獲取。相比之下，比濁法因其操作簡便、省時省力的優(yōu)點(diǎn)被較多應(yīng)用于微生物生長曲線的測定和建模研究中。然而由于比濁法具有檢測限高（106～107CFU/mL）、適用范圍窄（只可用于液體基質(zhì)的測定）等不足而導(dǎo)致獲得的生長延滯期存在一定偏差。隨著微生物定量技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、數(shù)字PCR、變性梯度凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)及生物傳感器等技術(shù)被應(yīng)用于預(yù)測微生物學(xué)的研究中，這些技術(shù)具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，改善了傳統(tǒng)方法的不足，具有良好的發(fā)展前景。表1總結(jié)了可應(yīng)用于測定食源性致病菌生長延滯期的相關(guān)技術(shù)。
表1可應(yīng)用于測定食源性致病菌生長延滯期的微生物定量方法
單細(xì)胞生長延滯期的測定不同于群體細(xì)胞，單細(xì)胞生長具有較大變異性，因此需獲取大量的實驗數(shù)據(jù)以體現(xiàn)其真實性。獲取單細(xì)胞生長延滯期最直接的方法是通過顯微鏡觀察單細(xì)胞的分裂過程，顯微觀測法從1932年Kelly等在顯微鏡下觀察到微生物單細(xì)胞分裂過程后得到快速的發(fā)展。然而，由于觀測視野中多個細(xì)胞連續(xù)分裂導(dǎo)致子代細(xì)胞很快布滿視野，因此大多數(shù)基于此方法的研究也只能觀測到細(xì)胞分裂2次或3次，不利于對單細(xì)胞進(jìn)行長時間的連續(xù)觀測。為解決這一缺陷，Elfwing等設(shè)計配有生長流動槽裝置的顯微觀測系統(tǒng)，此方法可通過提高流動液體流速將分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞沖走，使得目標(biāo)細(xì)胞的生長繁殖不會受到子代細(xì)胞生長的影響，同時采用低倍暗視野顯微鏡拍攝，能夠在同一批次的實驗中獲得大量單細(xì)胞的生長數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了對微生物單細(xì)胞生長的連續(xù)監(jiān)測，且通過改變流動液體環(huán)境還能夠研究不同條件下單細(xì)胞的生長規(guī)律。基于以上優(yōu)點(diǎn)，流動槽裝置已在許多單細(xì)胞的研究中得到應(yīng)用。隨著顯微觀測與計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，通過結(jié)合熒光來觀測單細(xì)胞生長已成為顯微觀測的發(fā)展趨勢之一，如激光掃描顯微鏡已被應(yīng)用于觀測熒光介導(dǎo)的單細(xì)胞生長分析中。此外，采用流式細(xì)胞儀結(jié)合不同的熒光染料也能獲取單細(xì)胞的生理指標(biāo)參數(shù)，如細(xì)胞膜完整性（可用熒光強(qiáng)度表征）、膜表面電位及胞內(nèi)pH值等，然而此方法不能連續(xù)地監(jiān)測單細(xì)胞的生長分裂過程。近年來，為長時間有效地監(jiān)測微生物單細(xì)胞在特定環(huán)境中的生長行為，單細(xì)胞的實驗芯片技術(shù)成為眾多研究的焦點(diǎn)，如在此基礎(chǔ)上研發(fā)的能夠觀測單細(xì)胞生長的微流體裝置。除直接觀測單細(xì)胞的生長分裂外，檢測時間法是間接推算單細(xì)胞生長延滯期的最常用方法，即通過全自動微生物生長曲線分析儀測定由初始吸光度增加至菌液濃度為106～107CFU/mL時對應(yīng)吸光度所需要的檢測時間。表2總結(jié)了應(yīng)用不同方法測定單細(xì)胞生長延滯期的相關(guān)研究。
表2應(yīng)用不同方法測定單細(xì)胞生長延滯期的相關(guān)研究
綜上所述，在食源性致病菌生長延滯期的測定中，群體水平上以傳統(tǒng)平板計數(shù)法為基礎(chǔ)的測定方法具有選擇性，且在實際操作中費(fèi)時費(fèi)力。新型的微生物定量方法具有較好的應(yīng)用前景，但每種方法都有自己的優(yōu)勢和弊端，食品基質(zhì)、致病菌的數(shù)量也均會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此需持續(xù)開發(fā)微生物定量新技術(shù)，以滿足檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、成本更低、檢測時間更短的要求。單細(xì)胞觀測方法上的創(chuàng)新是更加準(zhǔn)確地獲取大量且有效的生長數(shù)據(jù)的前提。在未來的研究中應(yīng)多關(guān)注于群體細(xì)胞生長延滯期及單細(xì)胞分裂所涉及的機(jī)理，并基于此而更加明確生長延滯期的定義，從而建立更快速、更準(zhǔn)確的測定方法。