新形式治療方法：等離子體對白假絲酵母菌的抑制、殺滅作用
選擇白假絲酵母菌ATCC10231作為實驗菌株，以低溫等離子體對其進行照射，觀察照射后菌落生長情況。經低溫等離子體照射30、60、120、180 s后，在培養基中心照射位置處，出現明顯的抑菌環，隨著照射時間的延長，抑菌環逐漸增大；連續觀察3 d，抑菌環沒有改變。低溫等離子體在體外可抑制白假絲酵母菌的生長，為其將來成為治療白假絲酵母菌感染的一種新手段提供了實驗室依據。
由于臨床上長期大量使用免疫抑制劑、廣譜抗生素，同時放化療、抗癌藥物的綜合應用，致使許多患者外源性真菌乘機侵入或者內源性真菌在體內大量生長繁殖，從而導致侵襲性真菌感染有了很明顯的上升趨勢，且導致系統性感染的病死率高達50%。國內外報道引起感染的真菌種類中，白假絲酵母菌最多見。近年來，等離子體醫學提供了一種新形式的治療方法，結合有效的物理效應，已成功地用于治療許多疾病，尤其在皮膚病領域。研究證實氬氣和氧氣的混合氣體下等離子體對枯草芽孢桿菌具有較高的殺滅效果，基于這些研究結果，該實驗對等離子體對白假絲酵母菌的抑制甚至殺滅作用進行研究。
1、實驗部分
1.1實驗材料
白假絲酵母菌ATCC10231標準株購自南京便診生物科技有限公司；沙堡瓊脂培養基SDA（4%葡萄糖、1%蛋白胨、2%瓊脂），YPD固體培養基（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%瓊脂）；研磨器、比濁儀、血細胞計數板、等離子體放電裝置；37℃恒溫培養箱（DHG-9202-DSA型，上海三發科學儀器有限公司）。
1.2實驗方法
1.2.1白假絲酵母菌菌懸液的制備
將白假絲酵母菌常溫解凍后，在沙堡瓊脂培養基SDA平皿上采用分區劃線，置于37℃培養箱內進行分離培養，純化菌種。3 d后挑取單個菌落，轉種于沙氏固體培養基上，在37℃恒溫培養箱中使其大量繁殖。再過3 d，重復上一步操作1次。3 d后，取培養基表面的白假絲酵母菌菌落，將其溶于少量0.9%氯化鈉溶液中，振蕩，使其徹底溶解，用比濁儀調整菌懸液濃度至（1～2）×108CFU／ml，并用血細胞計數板計數驗證，并將對其濃度進行調整達到1×108CFU／ml，最終再經過稀釋，得濃度分別為1×108、1×107CFU／ml的兩組白假絲酵母菌菌懸液。
1.2.2分組和制備反應
平皿選取30塊內徑7 cm的沙堡瓊脂培養基平皿，按試驗白假絲酵母菌菌懸液溶度分為兩個組，每組15塊平皿，分別取100μl白假絲酵母菌菌懸液置于每塊平皿的中央，然后用無菌三角玻璃棒將其均勻攤開，放置于水平試驗臺上靜置2～3 min。
1.2.3氬氣和氧氣的混合氣體的等離子體的照射
兩個濃度組的各15塊平皿，分為5個實驗組，每組3塊平皿，為了保證實驗結果具有隨機性和可重復性，每個小組的3塊平皿在相同實驗條件下同時進行實驗，以實驗1、實驗2和實驗3對其結果進行區分，分別照射0（即不經過等離子體照射，作為空白對照）、30、60、120、180 s，然后將經過等離子體照射過的平皿放置于37℃恒溫培養箱中培養觀察，連續3 d觀察等離子體照射對沙堡瓊脂培養基平皿上白假絲酵母菌的抑制作用。
1.3統計學處理
采用SPSS 16.0軟件進行分析，組間均值差異比較采用χ2檢驗。
2、結果
經過等離子體照射后實驗的第2天，即顯示兩個濃度組中除了各3塊空白對照平皿（沒有經過等離子體照射）外，其余12塊的沙堡瓊脂培養基平皿上，在等離子體照射的區域，出現了明顯的抑菌現象，連續觀察3 d，抑菌環的大小沒有發生明顯的改變，見圖1。抑菌環大小與菌液濃度呈負相關性，即菌液濃度越低，同樣照射時間產生的抑菌環更大，按濃度分組檢驗（F＝52.18，P＝7.38×10-7）；與等離子照射時間呈正相關性，即同樣濃度的菌液平皿，照射時間越長其產生的抑菌環越大，按照射時間分組檢驗（F＝16 511.82，P＝1.27×10-3），見表1。
表1兩濃度組在等離子射線不同照射時間下各組平皿內抑菌環的情況（cm）
3、討論
白假絲酵母菌是念珠菌屬中一種在臨床上很常見的條件致病菌，在正常機體內不易致病，但是對于一些自身免疫功能低下或嚴重受損的患者個體來說，則是可能危及其生命的重要致病菌。有文獻報道，在腫瘤放化療、骨髓移植后及艾滋病等患者人群中，醫院內真菌感染率高達10%，病死率甚至超過80%，對于上述患者，特別是出現位于深部臟器的白假絲酵母菌等真菌感染，已成為直接導致患者死亡的重要原因之一。目前在臨床上治療白假絲酵母菌感染，主要使用氟康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈及米卡芬凈等藥物，有口服和外用兩種，但是在深部真菌感染的患者中，尤其是系統性真菌感染的病例中，由于抗真菌藥物臨床使用時間一般比較長，不良反應大，導致患者依從性較差，大量耐藥的白假絲酵母菌菌株和新菌株的不斷出現，使得該病的治療越來越困難，復發率不斷的上升。本試驗研究中，以氬氣和氧氣混合氣體下的低溫等離子體照射對白假絲酵母菌產生了明顯的抑制作用，被照射平皿上菌落，在照射后的第2天，就在照射區域出現抑制，甚至不生長現象，同時連續觀察3 d，甚至更長時間，顯示在不同白假絲酵母菌濃度組各個不同照射時間下的培養平皿上，所產生的抑菌環及其大小均未消失或發生改變，這樣使得等離子體在臨床上治療白假絲酵母菌感染成為一種新的可能的方式。作為一個初步的探究，為臨床針對白假絲酵母菌感染性疾病的治療提供了一個新的思路，這與國內外目前的一些研究報道一致。
低溫等離子體抑菌機制包括等離子體物理和細胞分子生物學兩個方面，可能與低溫等離子體中的帶電粒子的擊穿作用和活性氧種的氧化作用導致微生物細胞壁、細胞膜的破裂有關。但是由于其成分復雜，在抑菌的過程中，究竟是帶電粒子（離子和電子）、紫外線、活性氧，還是射線起主要作用，國內外還存在較大的爭議。對于低溫等離子體對人體的照射是否會產生相應的副作用，最佳的照射治療時間，目前并不清楚，還需要進一步的研究。同時，目前的實驗研究還僅僅是在等離子體抑制白假絲酵母菌研究中進行了體外實驗部分的探究，如果需要徹底探究等離子體在臨床上治療白假絲酵母菌的應用前景，還需要做相應的動物模型實驗和臨床實驗研究。
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