柑桔砂皮病菌座殼菌生長條件及納米藥劑篩選（一）
柑桔是我國重要的經濟作物。近年,由子囊菌門真菌柑桔間座殼菌Diaporthecitri(無性態為柑桔擬莖點霉菌Phomopsiscitri,屬于半知菌類擬莖點霉屬)侵染引發的病害發展成為我國柑桔主要病害,因受害部位及癥狀不同,分別被稱為砂皮病(侵染葉片、小枝及幼果,患病組織表面常有紫褐色至黑褐色硬質、略突出的膠點,呈現為砂皮狀)、樹脂病(侵染枝干)、蒂腐病(侵染貯藏期果實)。防控該病原菌的為害主要依靠化學防治,三唑類、多菌靈、甲基硫菌、吡唑醚菌酯等殺菌劑效果良好。目前我國農藥劑型主要為乳油和可濕性粉劑等,載藥顆粒大,分散性能差,導致農藥易流失,利用率不高。近年來,納米材料在農業生產上得到應用,納米試劑可以改善農藥對靶標的親和性,減少流失與分解,控制藥物釋放速率,延長持效期,降低其在非靶標區域和環境中的投放量與殘留污染,從而實現農藥的減量增效。
本試驗從重慶市長壽區“愛媛38”(現在普遍被稱為“紅美人”)雜柑園采集典型砂皮病葉,分離純化及鑒定病原菌,研究其生物學特性,篩選對其具抑制作用的納米藥劑,以期為防控該菌侵染為害提供參考。
1材料與方法
1.1材料
2021年4—5月從重慶市長壽區“愛媛38”柑桔園采集砂皮病典型癥狀病葉。
培養基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA,馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、馬鈴薯蔗糖培養基(PSA,馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、胡蘿卜瓊脂培養基(CA,胡蘿卜200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、燕麥瓊脂培養基(OA,燕麥片30 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L)、Czapek培養基(硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g,氯化鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,硫酸鎂0.5 g,蔗糖30 g,瓊脂20 g,水1 L)。
納米試劑包括土霉素碳量子點(OTC-CQDs)納米試劑(西南大學柑桔研究所提供)、SiO2納米試劑(山東農業大學植物保護學院提供)和星狀陽離子聚合物(SPc)納米載體(中國農業大學植物保護學院提供)。
殺菌劑包括32%噻呋·氟環唑SC(山東省青島瀚生生物科技股份有限公司生產)、430 g/L戊唑醇SC(拜耳股份公司生產)和40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC(江西中迅農化有限公司生產)。
1.2方法
1.2.1病原菌分離與鑒定采用組織分離法,在病葉上取病健交界處組織3～4塊,消毒后放于PDA培養基上28℃恒溫培養7 d,純化分離菌株,然后接種于PDA培養基上24℃培養7 d,觀察菌落培養性狀、產孢結構、分生孢子形態特征等。
采用科赫氏法則鑒定分離菌株的致病性。將分離菌株培養7 d后,接種菌餅在柑桔果實刺傷處,以接種無菌PDA培養基為對照。使用無菌水浸濕脫脂棉保濕,28℃培養24 h后觀察癥狀。取接種果實發病處組織再次分離病菌,與接種菌進行比較。
提取分離菌株DNA進行分子鑒定。用滅菌的直徑5 mm的打孔器取菌餅,接種于PDA培養基上24℃恒溫保濕培養。當菌落擴展到培養皿的2/3時,用滅菌的接種鏟輕輕地刮取菌絲,置于滅菌研缽中加入液氮充分研磨,至粉末狀。用滅菌藥匙將菌絲粉末轉移到滅菌的1.5 mL離心管中,采用真菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA,然后利用真菌通用引物ITS1/ITS4對菌株進行PCR擴增。PCR反應體系含有2×Taq PCR MasterMix 12μL,引物ITS1 1μL,引物ITS4 1μL,模板DNA 2μL,ddH2O 9μL。PCR反應程序為94℃預變性4 min→(94℃變性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環)→72℃延伸10 min。擴增產物于4℃保存。將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度,然后用紫外凝膠成像系統觀察,檢測到單一清晰的條帶,純化后送測序公司測序。對測序所得序列,在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)數據庫中進行BLAST同源性比對,然后基于GenBank中報道的其他病原菌的序列信息,利用最大似然法(Maximum Likehood,ML)通過MEGA4.1軟件構建系統發育樹。
1.2.2病原菌生物學特性設置不同的碳源、氮源、光照、溫度及pH值等,觀測不同培養條件對分離菌株菌絲生長的影響。
培養基的影響:將直徑5 mm的菌餅接種在PDA、PSA、CA和OA平板上,將接種好的平板倒置在25℃恒溫培養箱中培養,每個處理重復3次,培養7 d后觀察培養性狀,用十字交叉法測菌落直徑,計算菌絲生長速度。
碳源的影響:基礎培養基為Czapek培養基,把Czapek培養基的蔗糖分別換為相同碳量的乳糖、甘油、麥芽糖、可溶性淀粉和甘露醇葡萄糖,以配制不同碳源的培養基,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復4次,25℃恒溫培養箱培養3 d后用十字交叉法測量菌落直徑,培養10 d后觀察培養性狀。
氮源的影響:基礎培養基為Czapek培養基,把Czapek培養基的硝酸鈉分別換為相同氮量的尿素、蛋白胨、賴氨酸、甘氨酸和氯化銨,以配制不同氮源培養基,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復4次,25℃恒溫培養箱培養3 d后用十字交叉法測量菌落直徑,培養10 d后觀察培養性狀。
光照的影響:將直徑5 mm菌餅接種PDA平板上,置于25℃恒溫培養,分別設置24 h全光照、12 h光暗交替和24 h全黑暗培養等光照條件,每處理組重復4次,培養3 d后用十字交叉法測量菌落直徑,培養10 d后觀察培養性狀。
溫度的影響:將直徑5 mm菌餅接種到PDA上,分別置于15、20、25、30、35℃等溫度條件下進行完全黑暗培養,每處理重復4次,培養2 d后用十字交叉法測量菌落直徑,培養7 d后觀察培養性狀。
pH值的影響:PDA培養基滅菌后,在無菌條件下利用鹽酸和氫氧化鈉溶液將PDA培養基pH值分別調為5、6、7、8和9,制成不同pH值的平板,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復4次,25℃恒溫培養箱培養2 d后用十字交叉法測量菌落直徑,培養7 d后觀察培養性狀。
1.3不同試劑對病菌抑制作用測定
供試各納米試劑和抑菌劑各配成一定濃度溶液,分別與PDA混合制成含藥平板,使含藥平板中供試藥劑最終濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001μg/mL等5個濃度處理,以加入等量無菌水的培養基為對照,每處理重復3次,接種直徑8 mm菌餅于平板中央,28℃恒溫培養7 d后,采用十字交叉法測量菌落直徑,計算各處理菌絲生長抑制率。抑制率(%)=[(對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-8)]×100。使用GraphPad prism 8軟件統計分析數據,將藥劑濃度換算成濃度對數(x),菌絲生長抑制率換算成抑制概率值(y),計算毒力回歸方程、相關系數(r)及抑制中濃度(EC50)。
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