綜述微生物修復菲污染中降解菌的菌屬、降解機理、分子機制、影響因素（三）
3、分子水平的研究
微生物降解作為去除土壤PAHs的主要方式，對其研究重點不再停留于單一尋找降解菌屬，而是深入探究其遺傳調控機制的同時構建高效工程菌。隨著研究范圍的不斷擴大，對分子水平上的認識也在不斷完善，如降解酶簇種類、編碼基因及基因坐落位置和關鍵基因的克隆等方面。
3.1降解酶簇種類
微生物降解菲是通過細胞內一些酶促反應實現的。細菌利用雙加氧酶而真菌依賴單加氧酶。這些降解酶都存在兩個特性：一是降解酶的表達依賴降解物的誘導；二是降解酶的底物專一性差。如惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaOUS82)，同一種雙加氧酶可以同時氧化菲、萘，而且此酶經過萘的誘導后又可以將多種芳香烴氧化成酚性物質如蒽、聯苯、硫芴、苯并苊等。以細菌為例，降解菲的過程主要涉及兩種關鍵酶，分別是羥基化雙加氧酶和鄰苯二酚雙加氧酶。
3.1.1羥基化雙加氧酶羥基化雙加氧酶(ring-hydroxylating dioxygenase,RHO)是細菌在降解菲代謝過程中的關鍵酶之一。由末端氧化酶(terminal oxygenase)和鐵氧還蛋白(ferredoxin)，以及鐵氧還蛋白還原酶(ferredoxin reductase)三部分功能蛋白組成的依賴NAD(P)H的酶系統。其中末端氧化酶是由ɑ亞基(含有鐵硫中心和單核鐵原子結構域)和β亞基構成的六聚體結構，具有催化和識別底物的作用，鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶負責加氧過程中電子的傳遞。羥基化雙加氧酶可以催化分子氧完成對芳香環的攻擊形成羥基化產物。在加氧的過程中，末端氧化酶、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶組成了一條電子傳遞鏈，鐵氧還蛋白還原酶將來自NADH的兩個電子傳給鐵氧還蛋白，由鐵氧還蛋白傳遞給具有催化和識別功能的末端氧化酶來處理。
3.1.2鄰苯二酚雙加氧酶鄰苯二酚雙加氧酶可以催化羥基化的底物使菲徹底開環，是降解代謝途徑另一個關鍵酶。包括鄰苯二酚1,2-雙加氧酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶。前者屬于內二元醇雙加氧酶，可以催化鄰苯二酚轉化為順,順-粘糠酸，斷裂發生在兩個羥基之間；后者屬于外二元醇雙加氧酶，催化鄰苯二酚轉化為2-羥基己二烯半醛，斷裂發生在某個羥基一側并且需要Fe2+的協助，由于C23O的活性依賴Fe2+，在反應過程中部分Fe2+會被氧化成Fe從而使C23O的活性受到了影響，因此C23O催化的開環反應是芳香化合物降解的限速步驟。在假單胞菌屬中C12O和C23O同時存在。
3.2降解基因
3.2.1降解基因的種類目前能降解多環芳烴菲的基因家族包括phd、phn、nid、nag等。其中研究最多的是phd、phn基因家族。phd基因在從毛單胞菌中的基因序列為phdAbAaBAcA dDE，其中phdAb基因編碼鐵氧化還原蛋白，phdAa基因編碼鐵氧化還原蛋白還原酶，phdB基因編碼順式-二羥基脫氫酶，phdAc和phdAd基因分別編碼鐵硫蛋白(ISP)的大(α)、小(β)亞基，phdD基因編碼異構酶，phdE基因編碼水合酶-醛縮酶。phn基因由9個開放閱讀框(ORFs)組成，順序為phnRSFECDAcAdB，其中phnR、S是調控基因，phnF基因編碼乙醛脫氫酶，phnE基因編碼水合酶-醛縮酶，phnC基因編碼外源型雙加氧酶，phnD基因編碼異構酶，phnAc基因和phnAd基因分別編碼起始雙加氧酶鐵硫蛋白(ISP)的大(α)、小(β)亞基，phnB基因編碼二羥基脫氫酶。
3.2.2降解基因的位置phn、phd、nid和nag基因家族等存在位置的多樣性，可能位于染色體上，或是存在于質粒中，也可能兩者兼有。當功能基因底物越復雜、降解對象含有的芳香環數量越多，其所在的操縱元就會越大，這時一般小質粒不能承載，通常由染色體或兩者共同負擔。表3為不同降解基因編碼的蛋白及存在的位置。
3.3功能基因的研究
有關菲降解基因的研究已取得長足的進步，很多實驗室從不同菌種中克隆得到了部分降解菲的基因片段并進行了功能驗證。Pinyakong等在Sphingomonassp.P2的兩個酶切片段上得到鐵硫蛋白的大小亞基基因及編碼鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶基因。Kiyohara等在Pseudomonas82的染色體DNA上得到pahAa、b、c、d及pahB、C、D、E、F的基因片段。Saito等在Pseudomonasputida中成功克隆了Nah基因。趙和平從PseudomonasputidaNCIB9816-4中克隆了nahAa、nahAb、nahAc、nahAd四個基因，分別編碼該雙加氧酶的三個組分Nap還原酶、Nap鐵氧還蛋白、鐵硫蛋白大小亞基。
表3不同降解基因編碼的蛋白及存在的位置
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