豨薟草果實內生細菌分離、鑒定、生長特性、抑菌效果及藥敏分析（一）
豨薟草有多種藥用價值，旨在從豨薟草果實中分離和篩選出高拮抗活性的內生細菌。采用了形態學觀察、生理生化試驗、16S rRNA序列比對、系統發育樹分析以及OD600值、藥敏試驗和超濾等方法對該抗感染細菌C-5-1進行了相關生物學特性評價。結果顯示，C-5-1為側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus），對多種病原細菌均敏感，尤其是對銅綠假單胞菌；低pH和高NaCl鹽度環境中耐受性有限，在pH≤5.0或鹽度≥15%時其生長受到了完全的抑制甚至是死亡，但在pH范圍7.0-11.0和鹽度范圍0-5%下均能生長良好，說明該菌株為耐堿，但不耐酸和鹽；篩選出了對菌株C-5-1高度敏感而對5種指示病原菌耐藥的抗生素，即氨芐西林；C-5-1發酵上清液中存在著兩種抗菌物質，且它們的相對分子質量均小于2 000。因此豨薟草有著優良微生物資源，可以成為開發抗感染細菌藥物的重要資源。
微生物已經成為新型抗感染藥物的重要來源之一。并且隨著分離技術的不斷進步，分離水平的不斷發展，更多的微生物可能會被人類發現利用。經研究發現，植物內生菌存在于各種藥用植物中，菌株分布廣種類多，且在與宿主長期進化過程中，形成了產生某些與宿主植物有著相同或者相似藥用價值能力的化合物。因此，藥用植物內生菌是一類具有重大開發潛力的微生物資源。
豨薟草為菊科植物的干燥地上部分，味苦、辛，性寒，小毒，歸肝腎經，可以祛風濕、通經絡、清熱解毒，治風濕痹痛、筋骨不利、腰膝無力、半身不遂、高血壓、瘧疾、黃疸、癰腫瘡毒、風疹濕瘡、蟲獸咬傷。近年來，國內外學者對豨薟草的研究越來越重視，但有關其內生菌資源的研究至今未見報道。
本研究以豨薟草中篩選分離得到的具有抗感染活性的內生細菌菌株為研究對象，并闡述其相關生物學特性，旨在為進一步研究該菌株的抗感染代謝產物提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1藥用植物
所用材料為無病蟲害、剛成熟的豨薟草果實，采自河南省洛陽市汝陽縣峴山。
1.1.2指示菌
5種病原細菌均由河南科技大學第一附屬醫院檢驗科細菌室提供。
1.1.3主要試劑
實驗中使用的PCR酶和DNA Marker購自大連寶生物公司；兩性霉素B購自上海生工；7種藥敏片（濃度均為30μg/片）購自北京賽為思生物技術開發中心；微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；其他化學試劑購自國藥集團。
1.1.4培養基組分
內生細菌分離采用改進的LB瓊脂培養基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，葡萄糖5，瓊脂粉20。液體發酵采用改進的LB液體培養基。為抑制真菌生長，以上培養基使用前，均需加入終濃度為50μg/mL的兩性霉素B（用二甲基亞砜溶解）。
1.2方法
區域內出露的地層主要為太古界太華群、中元古界長城系熊耳群、薊縣系高山河群、新元古界官道口群、中生界白堊系、新生界古近系、新近系和第四系等，其中太古界太華群在區域北部出露，構成本區古老的結晶基底，主要由一套變質達角閃巖相的中深變質巖及少量混合巖組成，為本區金礦物質的主要來源之一。
1.2.1內生細菌的分離與純化
內生細菌的分離是通過組織表面消毒來去除表生菌，具體操作如下：取新鮮豨薟草果實，用自來水洗凈，消毒紙吸干，滅菌刀片去皮，然后用無菌水再清洗一遍，接著用75%乙醇浸泡3 min后，用0.1%氯化汞漂洗1-2 min，最后用無菌水沖洗3次并吸干。將消毒后的果實切成6 mm大小的組織塊，種植于LB瓊脂平板上，于37℃靜置培養24 h，挑取少許劃線接種到新的LB瓊脂培養基上，反復純化至單一純菌落，置于4℃冰箱保存待用。為檢測試驗材料表面是否徹底消毒，取以上最后1次無菌水沖洗液涂布于LB平板上，于同等條件下培養作為對照，如對照平板無菌落長出即表明消毒徹底，后續試驗所分離到的細菌來自果實內部，即為內生菌。
1.2.2拮抗細菌的篩選
以病源細菌——金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌為指示菌，采用平板對峙法，每一種待測純菌落需做3次重復。無菌條件下，取100μL指示菌懸液（1×107CFU/mL）均勻涂布于LB平板上，將每個平板均分成4等份，20 min后將直徑約為6 mm的待測菌塊（瓊脂）貼附于指示菌平板中央（每一等份），37℃培養24 h，觀察各培養板指示菌的生長狀況及抑菌圈大小（包含菌塊直徑6 mm，下同），同時作陽性對照（以氯霉素藥片代替菌塊）。各菌株拮抗效果的判定標準為：抑菌圈直徑＞15 mm為高度敏感，抑菌圈直徑11-15 mm為中度敏感，抑菌圈直徑7-10 mm為低度敏感，無抑菌圈者為不敏感。
1.2.3菌種鑒定
（1）形態學鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》，革蘭氏染色和芽孢染色光學顯微鏡鏡檢，記錄其顯微形態。（2）生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》，對待測菌株進行相關生理生化指標測定（微量生化鑒定管）。（3）分子鑒定：將待測菌株接種于LB液體培養基中，37℃搖床過夜培養，CTAB法提取基因組，細菌16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'）對提取的基因組DNA進行PCR擴增。所得PCR產物送至上海生工測序。在NCBI數據庫上進行序列相似性分析，再利用MEGA 5.1軟件構建系統發育進化樹。
1.2.4藥敏試驗
為了后續試驗的開展，本研究需要對待測菌和5種指示菌做藥敏試驗。結合指示菌的臨床藥敏試驗結果，選取了6種藥敏片，即頭孢他啶、頭孢噻肟、復方新諾明、氨芐西林、青霉素以及四環素。
1.2.5生長特性分析
待測菌經LB液體活化3次，取活化好的種子液以1%的接種量分別接種到不同pH梯度（3.0、5.0、7.0、9.0、10.0和11.0）和NaCl濃度（1%、2%、5%、10%、15%和20%）的LB液體培養基中，37℃培養12 h后，在600 nm波長下測定OD值，以上每個梯度分別設置3個重復（為了滿足所測得的吸光度值與細菌濃度成線性比例關系，本實驗首先將不同梯度下的培養液進行稀釋至OD600=0.3-0.7，然后將所測得的具體數值乘以稀釋倍數即為該梯度下的OD600值）。
1.2.6抗菌代謝產物的初步純化
將待測菌株接入LB液體培養基中（50 mL），30℃，220 r/min振蕩培養48 h。發酵液經離心（8 000 r/min，10 min）去除菌體得上清，然后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機相和水相分別經旋轉蒸發濃縮至干，用2 mL無菌水將其溶解，取200μL測量對指示菌的拮抗活性，重復操作3次。將有抗菌活性的水溶液依次經過截留相對分子質量（Mr）為10 kD、5 kD和2 kD的超濾離心管，4℃，12 000 r/min下離心30 min，分別收集相應的濾出液及截留液，放入-70℃冰箱凍存，并進行冷凍干燥，得到的冷凍干燥粉末-70℃保存備用。使用前再將干燥粉末加入中2 mL無菌水，分別獲得濾出液及截留液。