棉子糖抑制變異鏈球菌生物膜形成機(jī)制研究進(jìn)展（二）
3.棉子糖對(duì)S.mutans GTF的影響
分析GTF相關(guān)基因的表達(dá)水平和葡聚糖產(chǎn)量，以評(píng)估棉子糖對(duì)S.mutans GTF的影響。如圖4A所示，在1000μM棉子糖處理的S.mutans生物膜細(xì)胞中，所有與GTF相關(guān)的基因都顯著下調(diào)。與對(duì)照相比，gtfB、gtfC和gtfD的表達(dá)分別下調(diào)了69%、74%和38%。與對(duì)照組相比，半乳糖還均勻地降低了GTF相關(guān)基因的表達(dá)40%到43%，而蔗糖則增加了GTF相關(guān)基因的表達(dá)水平，特別是gtfC和gtfD，分別增加了1.9到5.5倍(見圖S5A和B)。此外，當(dāng)棉子糖和蔗糖一起使用時(shí)，大多數(shù)GTF相關(guān)基因水平與對(duì)照組沒有顯著差異(見圖S5C)。16S rRNA內(nèi)參基因的表達(dá)不受任何處理的顯著影響。
用固體硫酸銨從含有蔗糖的腦心輸液(BHI)培養(yǎng)的S.mutans中提取GTFs，以評(píng)價(jià)其生產(chǎn)水不溶性葡聚糖的能力。然后將沉淀的GTF與棉子糖(0-1000μM)反應(yīng)。以蔗糖為底物，用分光光度計(jì)測(cè)量葡聚糖色強(qiáng)度來估算葡聚糖的產(chǎn)量。當(dāng)棉子糖濃度低于10μM時(shí)，S.mutans的葡聚糖產(chǎn)量沒有顯著變化(圖4B)。然而，在100-1000μM棉子糖處理后，葡聚糖產(chǎn)量下降了18%-39%，并呈濃度依賴關(guān)系。這些結(jié)果表明，棉子糖影響了GTF相關(guān)基因的表達(dá)，并降低了S.mutans葡聚糖的產(chǎn)量(圖5)。
S.mutans分泌的GTFs吸附在細(xì)胞膜和細(xì)菌表面。吸附的GTF與蔗糖衍生的葡聚糖結(jié)合。葡聚糖為S.mutans提供表面結(jié)合部位，介導(dǎo)對(duì)牙釉質(zhì)的黏附和緊密的細(xì)菌聚集，最終促進(jìn)生物膜的形成。然而，如果用棉子糖處理S.mutans生物膜，那么棉子糖有望阻止蔗糖衍生的葡聚糖與GTF結(jié)合。因此，S.mutans產(chǎn)生葡聚糖的活性降低，這可能會(huì)延緩生物膜的形成。
4.棉子糖在人工唾液包被HA爬片上的應(yīng)用
使用人工唾液涂層的HA爬片來模擬人類口腔環(huán)境的條件。通過對(duì)S.mutans在HA平板上生物膜細(xì)胞的染色和計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)S.mutans的粘附性。如圖6A所示，經(jīng)1000μM棉子糖處理的HA爬片上的S.mutans生物膜細(xì)胞與對(duì)照相比染色不佳，這表明棉子糖處理后S.mutans細(xì)胞難以附著在HA爬片上。菌落計(jì)數(shù)法也觀察到了類似的結(jié)果，在棉子糖處理后，HA爬片上的菌落數(shù)量減少(圖6B)。
圖6棉子糖(1000μM)處理后，S.mutans與涂有人工唾液的HA爬片的粘附性
(A)用CV染色評(píng)價(jià)細(xì)菌粘附性。在靜態(tài)條件下，將S.mutans生物膜在HA爬片上形成24 h，并對(duì)其進(jìn)行OD545檢測(cè)。(B)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)細(xì)菌粘附性。用標(biāo)準(zhǔn)平板培養(yǎng)法計(jì)算在HA爬片上形成的分離生物膜細(xì)胞的集落數(shù)。
此外，還通過掃描電子顯微鏡觀察了棉子糖對(duì)S.mutans在HA爬片上生物膜形成的影響。涂布人工唾液和未涂布人工唾液的HA爬片在掃描電子顯微鏡下的圖像沒有差別(圖7A和B)。圖7C和圖7D顯示了S.mutans生物膜在HA爬片上形成的掃描電子顯微鏡圖像。與對(duì)照組相比，1000μM棉子糖處理后生物膜的形成顯著減少。半乳糖也對(duì)生物膜的形成有不利影響，而蔗糖則增加了生物膜的形成(見圖S6)。這一發(fā)現(xiàn)表明，在與人類口腔環(huán)境相似的條件下，棉子糖可以有效地控制S.mutans生物被膜的形成。然而，這些結(jié)果并不能可靠地表明棉子糖在治療齲齒方面的適用性。為了用棉子糖預(yù)防或治療齲齒，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，包括臨床演示和開發(fā)有效的棉子糖應(yīng)用方法。
圖7棉子糖處理(1000μM)后的S.mutans生物膜在人工唾液涂層HA爬片上的掃描電子顯微鏡圖像。
(A)HA圓盤。(B)涂有人工唾液的透明質(zhì)酸圓盤。(C)人工唾液涂層透明質(zhì)酸圓盤上的S.mutans生物膜細(xì)胞。(D)人造唾液涂層HA爬片上經(jīng)棉子糖處理的S.mutans生物膜細(xì)胞。
圖S6經(jīng)1000μM蔗糖和半乳糖處理后，在人工唾液包裹的HA圓盤上S.mutans生物被膜的掃描電子顯微鏡圖像。
(A)涂有人工唾液的透明質(zhì)酸圓盤。(B)人工唾液涂層透明質(zhì)酸圓盤上的S.mutans生物膜。(C)人工唾液涂層透明質(zhì)酸圓盤上經(jīng)蔗糖處理的S.mutans生物膜。(D)經(jīng)半乳糖處理的S.mutans在人工唾液涂層的透明質(zhì)酸圓盤上的生物膜。
討論
在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)棉子糖可減少人類致齲菌形成的生物膜，其中棉子糖抑制S.mutans生物膜形成效果比S.sobrinus更有效(圖1)。S.mutans通過生產(chǎn)GTFs，以蔗糖為唯一底物合成粘性、水不溶/可溶性胞外葡聚糖，有助于增加細(xì)菌細(xì)胞表面的疏水性和生物膜的形成。RT-qPCR結(jié)果顯示，棉子糖主要下調(diào)S.mutans中g(shù)tfB和gtfC的表達(dá)(圖4A)。然而，經(jīng)棉子糖處理后，gtfD表達(dá)略有下降。接著，不溶性葡聚糖的產(chǎn)量隨棉子糖濃度的增加而下降(圖4B)。
由于在齲齒患者的整個(gè)唾液中檢測(cè)到大量的GTF，所以在本研究中，我們使用了唾液涂層的HA（牙釉質(zhì)的主要成分）。S.mutans分泌的GtfC通常被結(jié)合到細(xì)胞膜中，表面吸附的GtfC會(huì)利用蔗糖生產(chǎn)葡聚糖。在我們的研究中，棉子糖處理降低了葡聚糖的產(chǎn)生，S.mutans進(jìn)而難以粘附到唾液涂層的HA爬片，最終抑制HA爬片上生物膜的形成(圖5)。
在棉子糖和蔗糖共培養(yǎng)的S.mutans中，蔗糖消耗和生物膜形成減少(圖3A)，這表明棉子糖可能控制了S.mutans中GTF活性。這可能與棉子糖與GtfC結(jié)合的可能性有關(guān)(圖3C)。棉子糖中的半乳糖與關(guān)鍵氨基酸殘基Asp593以及亞基1位點(diǎn)的氨基酸殘基有額外的相互作用，這可能會(huì)增強(qiáng)其與葡聚糖酶的結(jié)合親和力。此外，在S.mutans中，半乳糖對(duì)生物膜形成和GTF基因表達(dá)的抑制活性與棉子糖類似，而蔗糖則相反(圖S1B和圖S5)。然而，這些結(jié)果并不能提供棉子糖與GtfC結(jié)合的直接證據(jù)，還需進(jìn)一步的研究需要闡明棉子糖影響S.mutans GTF活性的具體機(jī)制。
Nagasawa等人報(bào)道了棉子糖在低濃度的蔗糖中誘導(dǎo)S.mutans生物膜的形成，這與我們的發(fā)現(xiàn)相反。盡管兩項(xiàng)研究中生物膜形成的差異可能有很多原因，但我們謹(jǐn)慎認(rèn)為這種差異與棉子糖濃度有關(guān)。這可以解釋為，在高蔗糖水平下，棉子糖不足以抑制生物膜的形成，但這并不會(huì)降低棉子糖的活性。相反，0.03%以上的棉子糖處理會(huì)促進(jìn)S.mutans生物膜的形成。這種差異被認(rèn)為是由于用于抑制S.mutans生物膜形成的剩余棉子糖造成的。棉子糖可以作為鏈球菌中果糖基轉(zhuǎn)移酶的底物，但GTF不能利用棉子糖。因此，在應(yīng)用棉子糖調(diào)控S.mutans生物膜形成時(shí)，應(yīng)考慮確定適合環(huán)境條件的棉子糖濃度。
棉子糖作為一種在天然產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)的低聚糖，可以大大減少S.mutans在靜態(tài)和流動(dòng)條件下的生物膜形成。此外，經(jīng)1000μM處理后，GTF相關(guān)基因表達(dá)量和葡聚糖產(chǎn)量降低。并且，經(jīng)棉子糖處理后，細(xì)菌粘附減少，這減緩了在唾液涂層HA爬片上S.mutans生物膜的形成。因此，棉子糖作為一種天然物質(zhì)在口腔環(huán)境中具有防治S.mutans生物膜的潛力。
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