不同涂布方法與平板放置時間對乳酸菌的平板菌落計數法的影響
【摘要】目的研究不同涂布方法與平板放置時間對于平板菌落計數法的影響，為微生物計數研究提供基礎理論依據。方法分別比較圓形、井字、先圓形后井字和90°轉動平板橫線涂布方法以及平板放置3、6、9 h和12 h對于副干酪乳桿菌在乳酸細菌培養基（MRS）平板菌落計數的影響，并做分析。結果不同涂布方法對于活菌數的影響不明顯，而對于同一涂法方法來說，平板放置12 h后，微生物生長的菌落數最低。不同涂布方法相對標準偏差均大約在10%以內。結論在涂布平板做乳酸菌菌落計數時，同一稀釋度下，無論以何種涂布方式，將菌液均勻涂開即可達到菌落計數目的，但是菌落計數的最佳范圍應該在平板放置6～9 h以內。
平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋，在規定的條件下培養后，所得1 ml或1 cm2樣品中含菌落的總數。一般認為，一個肉眼可見的菌落代表原樣品中的一個單細胞。選擇合適的稀釋度并乘以相應的稀釋倍數就可以獲得樣品中微生物的數量。平板菌落計數法以其重復性好，能真實地反應樣品中活菌數量的優勢成為我國衛生標準規定的公認可行的方法，并且在食品藥品研究領域得到廣泛的應用。尤其在醫藥方面，控制口服制劑中微生物的污染狀況是藥品質量控制的重要指標，也是評價企業各生產環節衛生狀況的重要手段和依據。另一方面，平板菌落計數法也可用于檢測活菌制劑類藥物的活菌數量。乳酸菌是食品工業和醫藥行業中被廣泛應用的菌株之一，其活菌數的多少直接影響產品的質量和功能。因此，研究乳酸菌的平板菌落計數法的影響因素有助于提高其檢測的準確程度，進而有效控制藥品制作中微生物數量，提高產品品質。現將研究結果報告如下。
1、材料與方法
1.1材料MRS液體培養基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，吐溫（Tween）-80 1 ml，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水定容至1000 ml，調節pH值至5.8，121℃滅菌15 min，用于菌體的活化。MRS固體培養基：MRS液體培養基添加2%（W/V）的瓊脂粉，121℃滅菌15 min，用于菌落計數。BCN1360型生物潔凈工作臺；DHP-9082型電熱恒溫培養箱。
1.2方法菌體的活化從-80℃取出嗜酸乳桿菌復蘇純化，37℃、14 h活化兩代。
1.2.1菌懸液的制備將上述活化后的第三代嗜酸乳桿菌菌液用0.85%（W/V）的無菌氯化鈉溶液分別梯度稀釋至10-5、10-6、10-7，備用。
1.2.2涂布方法及平板放置時間的影響檢測分別采用圓形、井字、先圓形后井字和90°轉動平板橫線4種涂布方法，將10-5、10-6、10-7三個稀釋度的菌液涂布在分別放置了3、6、9、12 h的MRS平板上。37℃培養48 h后，挑選菌落數在30～300的平板計數。
2、結果
2.1不同涂布方法對于活菌數的影響不明顯，而對于同一涂布方法來說，平板放置12 h后，微生物生長的菌落數最低。見圖1。
2.2通過觀察發現不同涂布方法相對標準偏差均大約在10%以內。見表1。
3、討論
“2.1結果”可能是由于培養基在放置12 h后內部的水分活度沒有其他時間段利于微生物的生長。由于在試驗過程中發現平板放置3 h時培養基表面較滑，不利于涂布操作。綜合考慮，選擇放置6～9 h的平板更適于菌落計數。
測定樣品中的菌數方法主要有顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法、濁度測量法、粒子計數法、三磷酸腺苷（ATP）生物發光法、電阻抗測量法、放射測量法、接觸酶測量法等。這些方法都存在各自的適用范圍及優缺點。平板菌落計數法具有能檢測出活菌數，更真實地反映樣品狀況以及重復性好，樣品中菌數高或低都適用的特點，因此在藥品研究及實踐中廣泛應用。但是對于平板菌落計數法的影響因素研究卻甚少，通過本研究發現，涂布方法對于平板菌落計數的影響是不顯著的。相反，平板的放置時間對于最終菌落計數的結果有顯著性影響，當培養基放置時間過長（>12 h）時，水分活度的改變會影響所培養微生物的生長。這利于提高平板菌落計數的準確性，對更好地控制食品、藥品中微生物的數量具有重要意義。
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