維氏氣單胞菌分離與純化、一步生長曲線、熱穩定性及pH穩定性研究（一）
維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種人—獸—魚共患的條件致病菌，該菌可感染草魚、鯽、泥鰍、青蝦、中華絨螯蟹、中華條頸龜、達氏鱘、虹鱒、大黃魚等多種水生動物，引發的疾病發病快、死亡率高，對水產養殖業造成了巨大經濟損失。研究人員發現，維氏氣單胞菌對β-內酰胺類(氨芐西林鈉、苯唑西林)、大環內酯類(硫氰酸紅霉素、乙酰螺旋霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星)、氨基糖苷類(硫酸新霉素、卡那霉素)、四環素類(四環素、強力霉素)、磺胺類(磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑)、氯霉素類(甲砜霉素、氟苯尼考)等抗菌藥均產生了一定的耐藥性，且極可能會隨著抗菌藥的繼續濫用而在水生動物臨床上更加快速且廣泛地傳播。同時，抗菌藥的廣譜性會破壞水體環境及養殖動物腸道中正常微生物群系的平衡，影響養殖魚類的生長發育，進而造成水產養殖效率低下。因此，尋找安全、高效、環保的生物抑菌劑具有重要意義。噬菌體(Baceriophage)是一類能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物的病毒總稱，它具有裂解宿主專一性強、研發時間短，不影響正常菌群，對人和動物安全，耐藥風險低且無環境污染等優點，其在細菌病防控領域的應用研究呈逐年上升趨勢。
目前，已報道用于水生動物細菌病防控的噬菌體研究數量有限，為了豐富水產致病菌的噬菌體庫，篩選具有潛在應用價值的菌株，本試驗以維氏氣單胞菌為宿主菌，分離篩選烈性噬菌體，研究其生物學特性，旨在為進一步探索噬菌體防控技術提供科學依據。
1材料與方法
1.1菌株維氏氣單胞菌(XJJYCA01)分離自發病鯽魚，LB斜面保存于4℃。
1.2試劑與儀器試劑耗材：LB培養基、SM液、接種環、5 mL注射器、0.22μm過濾頭、一次性培養皿等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。儀器：UV-2600紫外分光光度計、離心機(Eppendorf Centrifuge 5427R和Hermle Z323K)、HS-2恒溫水浴鍋、Hitachi H-7650型電子顯微鏡、JJ-Y系列電子天平、生化培養箱等。
1.3噬菌體分離與純化
參照雙層平板法進行維氏氣單胞菌的富集、篩選、純化，略作修改。步驟如下：(1)無菌操作解剖，取發病鯽魚腸道置于滅菌培養皿中，用生理鹽水洗脫腸道內容物，4 000 r/min離心10 min后過0.22μm濾頭備用；(2)挑取維氏氣單胞菌(XJJYCA01)單菌落接種到含有5 mL LB液體培養基的試管中，28℃120 r/min搖床上過夜培養；翌日，將其轉到含25～30 mL液體培養基的錐形瓶中，28℃120 r/min震蕩培養3 h，使其達到對數期(OD值0.4～0.6)，然后向菌液中加入5 mL病魚腸道洗脫液，再28℃振蕩培養48 h。之后將混合液以12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清轉移至另一無菌螺旋離心管后備用；(3)取100μL分離液與200μL對數期的宿主菌混合，放置5～15 min后加到融化并冷卻至45℃的半固體培養基中，混勻立即倒入底層瓊脂平板上，鋪勻，28℃倒置培養24 h。翌日觀察噬菌斑的生成情況；(4)用滅菌牙簽挑取單個噬菌斑，接到5 mL液體培養基中富集10 min，然后向其中加入200μL宿主菌菌液，28℃培養2～3 h至液體澄清后，12 000 r/min離心取上清，即得到高效價的噬菌體。
1.4噬菌體效價的測定
采用噬斑法測定噬菌體效價。吸取100μL純化的噬菌體液進行10倍稀釋，將稀釋的噬菌體液分別與200μL的XJJYCA01混合，利用雙層平板法觀察噬菌斑的個數。效價(PFU/mL)=噬菌斑數×10×稀釋倍數。
1.5噬菌體的電鏡觀察
參照Ramíre-orozco等的方法，采用磷鎢酸負染法，用Hitachi H-7650型電子顯微鏡進行電鏡觀察。
1.6噬菌體最適感染復數(MOI)測定
培養XJJYCA01至對數生長期(OD600≈0.5，約為1×108CFU/mL)，按照不同的感染復數(1 000，100，10，1，0.1，0.01，0.001)各取0.2 mL混合，并加入1.6 mL的LB液體培養基，28℃培養4 h。經培養后，9 000 r/min離心10 min，0.22μm過濾。收集上清，測定噬菌體效價，以產生最高噬菌體效價的MOI為最佳感染復數。
1.7一步生長曲線
具體操作如下：將XJJYCA01培養至對數生長期。將噬菌體SJTJYCA01效價濃度稀釋到1×108PFU/mL。1 mL噬菌體稀釋液和10 mL宿主菌細菌懸液混合于錐形瓶P1中，混合10 min后，取0.1 mL加入到含有10 mL LB培養液的錐形瓶P2中，混合均勻，再從錐形瓶B2中取0.2 mL至含有20 mL液體培養基的P3中，混合均勻后在28℃及180 r/min條件下振蕩培養。從0開始每隔一段時間取樣。所取樣品經9 000 r/min離心2 min，取上清液用雙層平板法測定過濾液中噬菌體的效價。以取樣時間為橫坐標，噬菌體效價的對數值為縱坐標，繪制一步生長曲線。裂解量=裂解期平均噬菌體數/潛伏期平均噬菌體數。
1.8熱穩定性及pH穩定性
將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，分裝到3個5 mL離心管中，每管各裝3 mL。將離心管分別放置于40℃、60℃、80℃的恒溫水浴鍋中，每隔20 min測定各管中噬菌體的效價，直至測到60 min。以SM液為介質，用NaOH和HCl調節pH(3～11)。將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，取10μL加入到990μL不同pH的SM液中，28℃水浴2 h后測定各離心管中噬菌體的滴度。每個pH試驗重復3次。
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