苯乳酸對霍氏腸桿菌生長曲線、細胞凋亡、抑制活性、DNA的影響（一）
摘要 目的：探究苯乳酸（PLA）對霍氏腸桿菌及其生物被膜中的抑制作用。方法：通過最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、生長曲線、流式細胞術、堿性磷酸酶（AKP）活性、細胞膜完整性、DNA 含量、運動能力、生物被膜形成量的測定與激光共聚焦觀察等試驗，評價PLA 對霍氏腸桿菌及其生物被膜的抑制作用。結果：PLA 對霍氏腸桿菌的MIC 和MBC 分別為1.25 mg/mL 和2.5 mg/mL，在該質量濃度下可完全抑制霍氏腸桿菌生長。流式細胞儀檢測結果表明：1/2 MIC 和MIC 苯乳酸不會導致細胞凋亡和壞死，而2 MIC PLA 可造成細胞死亡。28 ℃培養下霍氏腸桿菌的生長曲線雖較37 ℃培養延滯近1 h，但未影響其最大生物量，且細胞凋亡率沒有顯著差異。PLA 破壞了細胞結構的完整性，造成細胞內AKP 活性降低，核酸與蛋白質泄漏；2 MIC PLA 可導致菌體DNA 含量顯著降低（P＜0.05）；PLA 處理可導致霍氏腸桿菌運動能力和生物被膜生成量降低。結論：PLA 對霍氏腸桿菌及其生物被膜有較強的抑制作用。
霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）是革蘭氏陰性直桿菌，周生鞭毛、兼性厭氧，可以從乳制品、牛奶、水果、蔬菜、大米和嬰兒奶粉等食品中分離出來。霍氏腸桿菌在特定條件下會引起動物和人感染，屬于條件性致病菌。霍氏腸桿菌與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）同屬于陰溝腸桿菌復合群，由于抗生素的過度使用和誤用，因此產生較強的耐藥性。
生物被膜（Biofilm，BF）是指細菌附著在有生命或無生命物體表面后被胞外大分子物質包裹的細菌群落。生物被膜具有較強的黏附性，成型后的生物被膜耐受性增強，因其具有很強的三維結構，故能構成物理屏障，限制和阻止抗菌劑或其它化學物質的穿透，導致生物被膜中的細菌難與抗菌劑接觸，產生對抗菌劑的抗性。霍氏腸桿菌會在食品與醫療設備、運輸管道和排水管道上形成生物被膜，且可以長時間存在，造成更多、更廣泛的污染。因此，有必要發現新的、天然的霍氏腸桿菌及其生物被膜的抑制劑。
苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）化學名2-羥基-3-苯基丙酸，是一種天然無毒且具有廣譜抑菌作用的新型生物防腐劑。有報道證實PLA 對大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）等有較好的抑菌活性。然而，目前有關苯乳酸對霍氏腸桿菌及其生物被膜抑制作用研究較少。
本文以霍氏腸桿菌為研究對象，測定苯乳酸對其最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，通過測定生長曲線、細胞凋亡率、細胞結構完整性、對DNA 的影響、細菌運動能力、生物被膜生成量及其微觀結構來分析苯乳酸對霍氏腸桿菌及其生物被膜的作用機制。
1 材料與方法
1.1 菌株與材料
霍氏腸桿菌，渤海大學食品科學與工程學院實驗室-80 ℃冰箱保存；苯乳酸、二乙酸熒光素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB 營養肉湯、LB 營養瓊脂培養基：青島高科園海博生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、結晶紫溶液、碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、吖啶橙染色液（Acridine orange，AO）、戊二醛，北京索萊寶科技有限公司；抗熒光淬滅封片劑，生工生物工程（上海）股份有限公司；堿性磷酸酶（AKP）測試盒，南京建成生物工程研究所；細菌基因組DNA 提取試劑盒、GeneRed 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 儀器與設備
SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺，蘇景集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-50L-Ⅰ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；LRH-150 型生化培養箱，昆山一恒儀器有限公司；MS105UD型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；THZ-D 型臺式恒溫振蕩器，蘇州培英實驗室設備有限公司；Sorvall Legend Micro21R 臺式微量離心機，美國Thermo Fisher 公司；全自動生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen 公司；Victor X3 型酶標儀，美國Perkin Elmer 公司；Accuri C6 Plus 流式細胞儀，上海實維實驗儀器技術有限公司；UV2550 型紫外-可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；F7000 熒光分光光度計，日本日立株式會社；GelDoc XR+全自動凝膠成像系統，美國Bio-Rad 公司；TCS-SP5 II 激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌懸液的制備 將貯藏于-80 ℃冰箱中的霍氏腸桿菌取出解凍，接種于LB 肉湯培養基中，分別在28 ℃和37 ℃，160 r/min 搖床中振蕩培養12 h 后，重新接種于新鮮LB 肉湯培養基中培養至霍氏腸桿菌對數生長期，稀釋至濃度為105～106 CFU/mL，備用。
1.3.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定 采用微量肉湯二倍稀釋法測定苯乳酸對霍氏腸桿菌的MIC。使苯乳酸終質量濃度分別為10.000，5.000，2.500，1.250，0.625，0.313，0.156，0.078 mg/mL。分別在28 ℃和37 ℃培養箱內靜置培養24 h，觀察結果。以肉眼觀察，無菌生長的最低質量濃度即為苯乳酸的MIC。將無菌生長的孔中培養液吸出100 μL 涂布于LB 營養瓊脂培養基平板上，分別繼續在28 ℃和37 ℃培養箱內靜置培養24 h，無菌落形成的濃度即為苯乳酸的MBC。
1.3.3 霍氏腸桿菌生長曲線的測定 將苯乳酸溶液加入到霍氏腸桿菌菌懸液中，使其終質量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC，以未添加苯乳酸的菌液為對照組，使用全自動生長曲線儀分別在28 ℃和37 ℃下培養24 h，每間隔1 h 測定OD600nm 值，并繪制霍氏腸桿菌生長曲線。
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