臨床微生物實驗室藥敏試驗三種擴散法的具體操作及試驗結果（一）
藥敏試驗是指細菌對抗菌藥物的敏感性試驗，通過藥敏試驗，能很好地掌握藥物對細菌的敏感性，為臨床選用抗菌藥物提供理論參考，以便準確有效地利用藥物進行預防治療。常用方法有紙片法、牛津杯法和打孔法等。通過對大腸桿菌的藥敏試驗，氧氟沙星、氟甲喹、新霉素為高敏，硫氰酸紅霉素、林可霉素為中敏。
抗菌藥對細菌性傳染病的預防、控制起到非常重要的作用，但因盲目、濫用抗菌藥，致使很多致病性細菌產(chǎn)生了耐藥性，使得抗菌藥對細菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖場（戶）造成了很大的經(jīng)濟損失，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的困惑。通過藥敏試驗，能很好地掌握藥物對細菌的敏感性，為臨床選用抗菌藥物提供理論參考，以便準確有效的利用藥物進行預防治療。筆者從事實驗工作30年，臨床微生物實驗室進行藥敏試驗的方法主要是擴散法，現(xiàn)將三種擴散法的具體操作及試驗結果介紹總結如下，供大家臨床用藥參考。
1材料和方法
1.1原理
藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而形成濃度梯度，由于抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC（最小抑菌濃度）呈負相關。
1.2材料
1.2.1菌種
臨床現(xiàn)場采取大腸。
1.2.2抗生素和抗菌藥
選用氧氟沙星可溶性粉（編號為1）、硫氰酸紅霉素可溶性粉（編號為2）、鹽酸林可霉素可溶性粉（編號為3）、氟甲喹可溶性粉（編號為4）、硫酸新霉素可溶性粉（編號為5）5種抗菌藥進行對比試驗。
1.3方法
1.3.1紙片法
將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上。
1.3.1.1紙片制備
取定性濾紙，用打孔機打成6 mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片200片分5份分別裝入清潔干燥的5個青霉素空瓶中，瓶口以報紙包扎。經(jīng)15磅15～2 min高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥備用。
1.3.1.2藥液的制備（用于商品藥的試驗）
挑選可溶性粉劑氧氟沙星（編號為1）、硫氰酸紅霉素（編號為2）、林可霉素（編號為3）、氟甲喹（編號為4）、新霉素（編號為5），按商品藥治療量的10倍的比例配制藥液。
1.3.1.3藥敏片的準備
在上述含有40片紙片的5個青霉素瓶內(nèi)分別加入氧氟沙星可溶性粉（編號為1）、硫氰酸紅霉素可溶性粉（編號為2）、鹽酸林可霉素可溶性粉（編號為3）、氟甲喹可溶性粉（編號為4）、硫酸新霉素可溶性粉（編號為5）的0.1%藥液10 ml，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液。翻動紙片時不能將紙片搗爛，同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3～6個月。
1.3.1.4普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
稱取瓊脂培養(yǎng)基22.5 g，加入500 ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，培養(yǎng)皿分裝，在培養(yǎng)皿的皿底劃十字形，標號（與抗菌藥物編號一致），消毒，備用。
1.3.1.5菌種的挑選、培養(yǎng)
將臨床癥狀和剖檢變化疑似大腸桿菌病的雞或豬的肝、脾、心臟，先用灼燒的手術剪在肝或心臟表面烙燙一下，剪取病料如肝、脾、心臟剪小塊直接放入肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h進行培養(yǎng)，備用。
1.3.1.6操作步驟
第1步，在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細菌混懸液，涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，涂好的培養(yǎng)皿放入37℃恒溫箱中20～30 min，效果更好。
第2步，將消毒鑷子夾取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。藥敏片有規(guī)律地貼于平皿培養(yǎng)基上，每種藥敏片要與相應的編號對應，每組重復3次，結果取平均值。
第3步，將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。
1.3.2牛津杯法
在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細菌混懸液，涂布于平皿培養(yǎng)基表面。操作、要求同紙片法。
無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管代替），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。
15 min后分別向各小管中滴加和藥敏片一樣量（25μL）的各種藥液，每組重復3次，結果取平均值。
將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。
1.3.3打孔法
在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的鑷子夾取消毒棉，蘸取待檢細菌混懸液，涂布于平皿培養(yǎng)基表面。操作、要求同紙片法。
無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4 mm、孔徑與孔距均為3 mm，管的兩端要光滑，也可用塑料管、玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。
待15 min后，分別向各孔中滴加和藥敏片一樣量（25μL）的各種藥液。每組重復3次，結果取平均值。
將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。
1.3.4判定標準
藥敏試驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。
表1藥物敏感試驗判定標準
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