腸炎沙門菌親本株和毒力島基因缺失株的生長曲線繪制
沙門菌毒力島基因SPI-1和SPI-2分別編碼III型分泌系統(tǒng)（T3SS）中的T3SS-1和T3SS-2，T3SS可以將沙門菌分泌的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞中。
為分析毒力島基因SPI-1和SPI-2缺失對腸炎沙門菌生物學(xué)特性、致病性和免疫原性的影響，本實驗室前期構(gòu)建了腸炎沙門菌SM6株毒力島基因SPI-1和SPI-2雙缺失株（SM6ΔT3SS），本研究通過繪制親本株和缺失株的生長曲線，采用掃描電鏡觀察二者的形態(tài)，并測定二者對人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）的黏附性與侵襲力。生長曲線結(jié)果顯示，培養(yǎng)5 h時，SM6ΔT3SS株的生長速度顯著快于親本株SM6（P<0.05），自6 h起SM6ΔT3SS株的生長速度極顯著快于SM6株（P<0.01）。
掃描電鏡觀察可見，親本株菌體多單個存在，而缺失株則出現(xiàn)明顯的菌體聚集，且其表面被類似膠狀物包裹。
黏附性與侵襲力結(jié)果顯示，與親本株SM6相比，缺失株SM6ΔT3SS黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的數(shù)量均極顯著下降（P<0.001、P<0.001）。
上述結(jié)果表明，毒力島基因SPI-1和SPI-2的缺失可能改變了細(xì)菌的生長、代謝、分泌及或結(jié)構(gòu)等特征，導(dǎo)致沙門菌的生物學(xué)特性的改變及降低了其對腸上皮細(xì)胞的黏附性和侵襲力。以1×107 cfu/100 μL的劑量經(jīng)腹腔注射感染7日齡SPF雞，并于感染后不同時間檢測缺失株在SPF雞盲腸、肝臟和脾臟的載菌量；將缺失株以1×107 cfu/100 μL的劑量經(jīng)腹腔注射免疫7、21和35日齡雞，在首免后不同時間采血，采用間接ELISA檢測各組雞血清中的IgG抗體水平；在首免后42 d時經(jīng)腹腔注射1×109 cfu/100 μL/只的沙門菌SM6株，并于攻毒后7 d和14 d采血連同免疫期間采集的血一起采用間接ELISA檢測各組雞血清中IL-4和IFN-γ的分泌水平。
在攻毒后14 d 內(nèi)觀察并統(tǒng)計各組雞的臨床癥狀及死亡率。攻毒后7 d各組均剖殺部分雞，采集其盲腸和肝臟組織制備病理切片觀察各組織病理變化，評價該缺失株的免疫效力。
載菌量結(jié)果顯示，感染后2 d，缺失株在雞脾臟和肝臟中的載菌量極顯著低于親本株（P<0.001），但在盲腸中的載菌量極顯著高于親本株（P<0.01）；感染后4 d，缺失株在肝臟和盲腸中的載菌量極顯著和顯著低于親本株（P<0.01、P<0.05）；感染后8 d，缺失株在脾臟中的載菌量極顯著低于親本株（P<0.01），且兩組雞在上述臟器中的載菌量均降至較低水平；抗體和細(xì)胞因子的ELISA檢測結(jié)果顯示，首免后14 d，免疫組雞的抗體水平顯著高于對照組（P<0.05）。從免疫后21 d，免疫組雞的抗體水平均極顯著高于對照組雞（P<0.001）；免疫期血清中IFN-γ的分泌水平無明顯變化，IL-4的含量在免疫后42 d極顯著高于對照組（P<0.01）；攻毒后雞血清中IFN-γ和IL-4的含量均顯著高于對照組（P<0.05）。整個實驗期SM6ΔT3SS免疫組雞均存活且無明顯的臨床癥狀、無死亡，肝臟和腸黏膜僅出現(xiàn)輕微病理損傷，對照組雞組雞攻毒后14 d內(nèi)死亡率達(dá)80%，肝臟和腸黏膜均出顯較明顯的病變。
上述結(jié)果表明，SM6ΔT3SS株能夠刺激SPF雞產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對SPF雞的致病性降低，并對雞有較好的免疫保護(hù)效力。本研究為闡明沙門菌致病機(jī)制和研發(fā)安全有效的沙門菌減毒活疫苗奠定了良好基礎(chǔ)，也為沙門菌病的防控提供了新思路。
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