朱鹮細(xì)胞系的建立、體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定（一）
朱鹮(Nipponia nippon)屬鸛形目(Ciconiiformes)鹮科(Threskiornithidae)朱鹮屬(Nipponia),是世界級珍稀瀕危物種,國家I級重點(diǎn)保護(hù)鳥類。朱鹮曾經(jīng)廣泛分布于日本、朝鮮半島、中國和俄羅斯西伯利亞西南部。然而,20世紀(jì)中葉以來,由于環(huán)境污染、全球氣候變暖、捕獵和人類活動等因素的影響,朱鹮的數(shù)量急劇減少,野生種群在日本、朝鮮半島和俄羅斯的分布地區(qū)先后消失。中國自從1964年在甘肅康縣采集到一只標(biāo)本后,直到1981年的近20年一直沒有朱鹮的報道（Ding,2004)。1981年野生朱鹮種群(7只)在陜西洋縣被重新發(fā)現(xiàn)（Liu,1981)。此后,我國在朱鹮的保護(hù)和研究方面開展了大量的工作,主要包括朱鹮生態(tài)生物學(xué)、保護(hù)生物學(xué)、遺傳學(xué)、解剖學(xué)、飼養(yǎng)繁殖、病理學(xué)、疾病防治以及保護(hù)管理和再引入等。由于國家的高度重視,野生朱鹮及其棲息地得到了有效保護(hù),野生種群數(shù)量不斷增加。同時,朱鹮人工飼養(yǎng)繁殖也與野生種群的保護(hù)同步進(jìn)行。1989年,北京動物園人工繁殖朱鹮在世界上首次獲得成功(Li,1989)。隨后三個朱鹮人工種群分別在北京和陜西建立,有力保證了朱鹮種群的恢復(fù)和發(fā)展。大量的研究工作也為朱鹮的科學(xué)保護(hù)奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)（Ding,2004)。
野生動物的遺傳資源保護(hù),除建立專門的保護(hù)機(jī)構(gòu)、制定相關(guān)法律和建立國家公園、自然保護(hù)區(qū)及易地保護(hù)外,以深低溫(-196°C)凍存動物的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞則為另一條有效的途徑(Shi,1989)。細(xì)胞是生命的基本單位,具有生命所有的遺傳信息。動物體細(xì)胞系的建立,為從細(xì)胞和分子水平開展各類研究提供經(jīng)濟(jì)、方便的材料來源,也為以后再建當(dāng)時或許已滅絕的物種提供材料儲備。迄今為止,還沒有關(guān)于朱鹮體細(xì)胞成功建系的報道。對我國的朱鹮,Liu et al（1992)報道了兩只飼養(yǎng)于北京動物園的朱鹮的染色體性別鑒定及核型分析的結(jié)果,但未見朱鹮染色體G帶、C帶和Ag帶的報道。
本研究利用微創(chuàng)取樣方法,在不對朱鹮造成致命傷害的前提下,獲得其皮膚樣本,成功建立了朱鹮的體細(xì)胞系,并對該細(xì)胞系的體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定以及染色體G帶、C帶和Ag帶等進(jìn)行了分析。
1材料和方法
1.1材料來源
雌、雄兩只成年朱鹮均來自陜西朱鹮人工繁殖中心。取材前徹底消毒背部皮膚,用眼科剪剪下～0.5 cm×1 cm的一塊皮膚,迅速放入運(yùn)輸培養(yǎng)基內(nèi)。動物行傷口縫合處理后放回飼養(yǎng)網(wǎng)。
1.2細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)用運(yùn)輸液為含有100 U/mL青霉素鈉以及100μg/mL鏈霉素的DMEM(GIBCO);生長液為含有10%胎牛血清的OPTI-MEM(GIBCO),pH 7.2～7.4;培養(yǎng)器皿為培養(yǎng)面積25 cm2的一次性塑料培養(yǎng)瓶(Corning)。
1.2.1原代細(xì)胞培養(yǎng)
使用含兩倍雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌皮膚組織塊5次,剪小至～1 mm;加入0.25%胰酶(1:250,Amresco)0.5 mL消化0.5 min后迅速加入生長液抑制胰酶作用;PBS清洗一次后,將組織塊貼至培養(yǎng)瓶瓶壁,1 h后加入1 mL生長液,37°C培養(yǎng)24 h后補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 mL;此后每3天換液一次。待15 d后可見細(xì)胞開始從組織塊長出,再培養(yǎng)5 d后即可傳代。
1.2.2細(xì)胞傳代
待組織塊周圍細(xì)胞均長成致密的單層后即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄去生長液,PBS清洗一次后加入0.25%胰蛋白酶1 mL,37°C消化1～2 min后加入5 mL新鮮生長液;輕拍瓶壁分散細(xì)胞,補(bǔ)加生長液至15 mL后吸出一半至另外一個培養(yǎng)瓶(1:2傳代);37°C,5%CO2條件下培養(yǎng),待長成單層后,再按上述方法傳代。
1.2.3細(xì)胞凍存
用0.25%胰酶消化、收集對數(shù)生長期細(xì)胞,離心后棄去上清液;加入新鮮配制的凍存液[小牛血清90%,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,Amresco)10%]制備成2×106個/mL的細(xì)胞懸液,每個凍存管分裝1 mL;凍存管置于程序凍存盒(Nalgen)內(nèi),-80°C過夜后,移入液氮內(nèi)長期保存。
1.2.4細(xì)胞復(fù)蘇
從液氮中取出凍存管后迅速放入37°C水浴中,讓細(xì)胞在1～2 min內(nèi)完全融化;在無菌環(huán)境下將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶內(nèi),37°C,5%CO2條件下培養(yǎng)。3 d后細(xì)胞即可長成單層。
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