傳統(tǒng)腌干魚制品中降解生物胺菌株的篩選、生長曲線及影響因素（一）
為獲得用于咸魚等腌制水產(chǎn)品的生物胺降解菌，本文采用生物胺初篩培養(yǎng)基與高效液相色譜技術(shù)分析，研究從傳統(tǒng)方法加工的咸魚中分離篩選具有降解生物胺的菌株，通過VITEK 2鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定，并分析菌株的生長曲線、降解生物胺動力學(xué)、溫度、pH、鹽度、生物胺底物濃度等特性，及在咸魚中接種菌株對產(chǎn)品生物胺的影響。結(jié)果表明:從咸魚中分離篩選到三株具有降解生物胺的菌株，分別是鼠李糖乳酸菌(Lactobacillusrhamnosus，Lr)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，Lp)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，Pp);對生物胺降解的最適溫度為30～35℃，最適pH為5.5～6.0，對食鹽有較好的耐受性，在食鹽濃度≤80 g/L時對生物胺的降解作用尤為明顯，Lr與Lp之間無拮抗作用;接種了生物胺降解菌的咸魚產(chǎn)品中腐胺、尸胺、組胺、酪胺等生物胺含量均顯著性降低(p<0.05)，而接種Lr∶Lp=1∶2的混合菌種的咸魚產(chǎn)品生物胺含量下降幅度最大。
腌制咸魚是一種風(fēng)味獨特的傳統(tǒng)水產(chǎn)品，深受廣大消費者的喜愛。其傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝屬自然發(fā)酵，發(fā)酵過程微生物種類復(fù)雜，產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性難以得到保證。生物胺普遍存在于蛋白質(zhì)含量豐富的發(fā)酵食品中，如發(fā)酵香腸、干酪、咸魚、魚露等。當(dāng)其在人體內(nèi)積累到較高數(shù)量時就會出現(xiàn)一些諸如頭痛、惡心、痙攣等一系列中毒性狀，嚴(yán)重的甚至?xí)＜吧Ｉ锇泛渴俏⑸锓置诘陌被崦擊让负蜕锇费趸腹餐饔玫慕Y(jié)果，即脫羧酶催化氨基酸脫羧基，產(chǎn)生并積累生物胺，生物胺氧化酶則氧化并降解生物胺。
長期以來，研究人員一直在嘗試開發(fā)能有效控制生物胺的方法，大部分都是通過抑制食品中生物胺產(chǎn)生菌的數(shù)量或氨基酸脫羧酶的活性來減少生物胺的產(chǎn)生，如輻照、低溫貯藏、真空包裝等，這些方法在一定程度上可以減少生物胺的產(chǎn)生，但不能消除已產(chǎn)生的生物胺。近年來，具有胺氧化酶的微生物成為研究熱點，通過接種無氨基酸脫羧酶或含生物胺氧化酶的微生物制劑，使其在發(fā)酵過程中成為優(yōu)勢菌，從而降解生物胺或抑制生物胺的生成。目前國內(nèi)外對乳酸菌降解生物胺開展了相關(guān)研究。馬宇霞等從熏馬腸中分離鑒定了6株生物胺氧化酶菌株，其中包括鼠李糖乳酸菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌三株乳酸菌;Tosukhowong等研究了植物乳桿菌BCC 9546作為一種降解菌對發(fā)酵香腸中生物胺的降解作用;Nie等報道了銀魚香腸接種植物乳桿菌后會對其生物胺產(chǎn)生影響。
目前有關(guān)乳酸菌的降解特性還未見文獻報道，因此，本實驗室從傳統(tǒng)腌干魚制品中分離篩選具有生物胺降解活性的微生物，為腌干魚加工過程中發(fā)酵劑的選擇提供菌種來源，提高其可食用安全性，并探討溫度、pH、食鹽濃度和生物胺底物濃度對生物胺降解的影響，為生物胺的控制研究提供理論依據(jù)，并為腌干魚的工藝革新提供參考。
1材料與方法
1.1材料與儀器
咸魚傳統(tǒng)法腌制，實驗室自制;生物胺標(biāo)準(zhǔn)品:腐胺(PUT)(≥98%)、尸胺(CAD)(≥95%)、組胺(HIS)(≥99%)、酪胺(TYR)(≥99%)均購自美國Sigma公司;乙腈(色譜純)、丹磺酰氯(Dns-Cl，≥99%)、甲醇(色譜純)均購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司;丙酮(色譜純)購自美國Burdick&Jackson公司;MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;其它化學(xué)試劑均為分析純，購于廣州粵升試劑公司;實驗用水均為超純水。
Agilent 1100高效液相色譜儀美國Agilent公司;立式蒸汽壓力滅菌鍋388型上海申安醫(yī)療器械廠;3K30冷凍離心機美國Sigma公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺江蘇蘇凈安泰公司;SPX-320生化培養(yǎng)箱寧波東南儀器廠;TU-1990紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;T25高速均質(zhì)機德國IKA公司;熱泵除濕干燥箱上海一恒科技有限公司;VITEK 2 Compact菌種鑒定系統(tǒng)法國生物梅里埃公司。
1.2實驗方法
1.2.1降解生物胺菌的篩選及鑒定在無菌條件下取咸魚背部肌肉10 g，剪碎后放入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，混合均勻，用無菌生理鹽水依次稀釋為102、103、104倍，取1 mL上述不同濃度的稀釋液涂布于MRS培養(yǎng)基中，然后置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑單菌落以平板劃線的方法多次純化。將純化后的單菌落分別接入到改良型MRS肉湯培養(yǎng)基中，以不接種菌的培養(yǎng)基作對照，30℃培養(yǎng)48 h后取樣，測定培養(yǎng)基中的生物胺含量。將具有生物胺降解活性的乳酸菌接種于3 mL無菌鹽水(4.5 g/L NaCl，pH4.5～7.0)中，混勻，用比濁儀配制相當(dāng)于0.80～0.10麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海褂肰ITEK 2全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定。
1.2.2生物胺降解菌的生長曲線測定
將乳酸菌活化后，以2%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于30℃條件下培養(yǎng)，在48 h內(nèi)每隔6 h取一定量的菌液，稀釋到適宜倍數(shù)，測定OD600值。
1.2.3菌株對混合生物胺的降解動力學(xué)研究
將菌活化后，以2%的接種量分別接種于50 mL，pH為5.5的含四種生物胺(腐胺、尸胺、組胺和酪胺，濃度分別為100 mg/L)的MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別置于30℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，以未接種的培養(yǎng)基作空白對照，在48 h內(nèi)每隔6 h取樣檢測實驗組和對照組培養(yǎng)基中生物胺含量，根據(jù)公式1計算各生物胺的降解率，繪制菌株對混合生物胺的降解動力學(xué)曲線。
式(1)
式中:W0-對照組中生物胺的含量，mg/L;W1-實驗組中生物胺的含量，mg/L。
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