稻花香馫香型根霉曲、中高溫大曲和高溫大曲的酶活力和微生物數量統計（下）
2.3.2高通量測序分析微生物群落組成
在門水平和屬水平上分別計算了各樣本的細菌群落的物種平均相對豐度（n=3），如圖2所示。（1）高溫大曲（GW）在門水平上的優勢菌群（平均相對豐度＞1%）包括Firmicutes（厚壁菌門，50.13%），Proreobacteria（變形菌門，33.13%）和Actinobacteria（放線菌門，15.84%）；在屬水平上有Bacillus（芽孢桿菌屬，32%），Kroppenstedtia（21.6%），Saccharopolyspora（糖多孢菌屬，18.06%），Thermoactinomyces（高溫放線菌屬，9.01%），Norank_f_Pseudonocardiaceae（4.93%），Planifilum（3.4%），Staphylococcus（葡萄球菌屬，3.13%）和Pediococcus（片球菌屬，1.75%）。（2）中高溫大曲（ZGW）在門水平上的優勢菌群有Firmicutes（厚壁菌門，50.76%），Proteobacteria（變形菌門，21.21%）和Actinobacteria（放線菌門，14.81%）；在屬水平上有Bacillus（芽孢桿菌屬，17.96%），Kroppenstedtia（16.23%），Thermoactinomyces（高溫放線菌屬，8.73%），Weissella（魏斯氏菌屬，5.48%），Lactobacillus（乳桿菌屬，3.8%），Pediococcus（片球菌屬，2.46%），Planifilum（1.96%）和Staphylococcus（葡萄球菌屬，1.69%）。（3）根霉曲在目水平未分類。
在門水平和屬水平上分別計算了各樣本的真菌群落的物種平均相對豐度（n=3），如圖3所示。（1）高溫曲（GW）在門水平上的優勢菌群（平均相對豐度＞1%）為Ascomycota（子囊菌門，99.86%），在屬水平上有Thermomyces（嗜熱真菌屬，79.49%），Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，13.98%），Aspergillus（曲霉菌屬，1.91%）。（2）中高溫大曲（ZGW）在門水平上的優勢菌群有Ascomycota（子囊門，86.27%），Mucoromycota（毛霉門，5.46%）和Basidiomycota（擔子菌門，8.19%）；在屬水平上有Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，62.72%），Thermomy-ces（嗜熱真菌屬，4.53%），Cutaneotrichosporon（5.56%），Candida（假絲酵母屬，3.53%），Rhizopus（根霉菌屬，5.36%），Aspergillus（曲霉菌屬，3.04%），Hyphopichia（2.29%），Trichomonascus（2.29%）和Xeromyces（耐干霉菌屬，1.89%）。（3）Rhizopus（根霉菌）作為根霉曲中的優勢菌種，豐度達99.99%。
2.4物種Venn圖
Venn圖能夠得到不同樣品之間相同的物種組成，3種曲的Venn圖分析如圖4所示。3種曲共有的細菌屬有25種，中高溫大曲和高溫大曲共有的細菌屬有185種，中高溫大曲和高溫大曲分別與根霉曲的物種重合有37和26種。其中，中高溫大曲物種最為豐富，達591種，高溫大曲210種，而根霉曲只有41種。3種曲共有的真菌屬有4種，中高溫大曲和高溫大曲共有39種。其中物種最多的是中高溫大曲96種，而高溫大曲和根霉曲分別只有49種和5種。
圖4樣品屬水平細菌（A）和真菌（B）venn圖
3討論
作為白酒釀造過程中起重要作用的液化酶和糖化酶，直接影響著原料中淀粉的轉化效率及出酒率。酸性蛋白酶可以分解原料中的大分子蛋白，為微生物生長提供氮源，促進發酵。酯化力是大曲自身經發酵成熟后固有的催化醇和羧酸生成酯的能力，而生成的酯是濃（醬）香型白酒重要的主體香味物質。本研究發現，中高溫大曲的糖化力更高；根霉曲的酸性蛋白酶活和酯化力大于高溫大曲和中高溫大曲。因此3種曲在稻花香馫香型白酒釀造的不同階段加入，不僅有利于提高出酒率，還有利于馫香型香氣的形成。
大曲微生物代謝產生的乙醇和各種風味物質，是白酒的關鍵組分。本研究首先使用平板計數測定微生物數量，結果表明，中高溫大曲的霉菌、酵母菌、芽孢桿菌以及總細菌數量高于高溫大曲。微生物計數雖然對微生物進行了絕對定量，并側面反映了大曲中微生物的生長趨勢，但由于僅僅反映的是可培養微生物，且受環境中的溫度、濕度和氣候等因素影響很大,因此，對大曲微生物的認識存在很大的局限性。本研究針對上述問題，通過高通量測序技術分析了稻花香馫香白酒3種酒曲微生物群落多樣性及組成。在測定的3種酒曲中，根霉曲的Shannon指數最小，其中根霉菌的相對豐度達99.99%，而中高溫大曲相比高溫大曲和根霉曲而言，其細菌和真菌群落的Shannon指數更高，具有更高的物種豐富度和均勻度，并且在屬水平上擁有近600種細菌，真菌也有將近100種。這可能是由于高溫大曲的品溫過高，引起不耐高溫微生物在制曲過程中死亡；而根霉曲采用的是純種制曲，基本以根霉菌為主，也包括極少量來自環境及工具的細菌。
制曲溫度影響著大曲微生物群落結構的組成。本研究發現，中高溫大曲和高溫大曲細菌群落都由Bacillus（芽孢桿菌屬）占主導地位，豐度分別為17.96%和32%，側面印證了傳統稀釋涂平板法中芽孢桿菌占總細菌的絕大多數的結果。同時還發現中高溫大曲的細菌相較于高溫大曲而言，Thermoactinomyces（高溫放線菌屬）和Bacillus（芽孢桿菌屬）明顯下降。芽孢桿菌產多種蛋白酶，是大曲中風味物質的主要來源。高溫放線菌屬常見于自然界高溫場所，具備耐高溫特性，適應大曲發酵中的高溫環境，具備開發高溫淀粉酶、蛋白酶、酯酶、脫氫酶和多酚氧化酶等潛力。在真菌群落組成中，Thermomyces（嗜熱真菌屬）在高溫大曲的相對豐度遠高于中高溫大曲（4.53%），達79.49%。而Thermoascus（嗜熱子囊菌屬）作為中高溫大曲中占主導地位的真菌屬，相對豐度達62.72%，遠高于高溫大曲中的豐度（13.98%）。嗜熱真菌屬產木聚糖酶和蛋白酶等酶類，李欣等發現嗜熱真菌屬是酒醅發酵過程中產酶的主要功能菌。嗜熱子囊菌產纖維素酶和蛋白酶，可降解糖類和蛋白質等并具有良好的熱穩定性,有利于大曲產酒生香作用。兩種大曲擁有不同的微生物群落組成，可能是由于不同的制曲溫度引起的：高溫大曲培菌溫度在63～68℃之間，中高溫大曲培菌溫度在55～60℃之間。根霉曲中，根霉菌產糖化酶、液化酶、蛋白酶和脂肪酶，還能產生各種有機酸，可為其他微生物的代謝提供基礎物質，對整個糖化發酵過程以及白酒的風味都具有一定影響。
本研究系統性地檢測分析了稻花香酒廠用于馫香型白酒釀造的3種曲（中高溫大曲、高溫大曲和根霉曲）中微生物的群落結構，同時對曲樣的酶學指標進行測定，簡單分析了酒曲中細菌真菌數量及群落結構的差異和酶活力之間的關系，為優化稻花香酒曲工藝、提高酒曲質量提供了參考依據，具有理論和實踐意義。
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