鐵皮、疊鞘石斛提取物對(duì)沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)狀況、群體運(yùn)動(dòng)的影響——摘要、材料與設(shè)備
摘 要 傳統(tǒng)抑菌劑的泛用使細(xì)菌表現(xiàn)出日趨嚴(yán)重的耐藥性,以群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶點(diǎn)的新型抑菌劑具有不使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì)。該研究旨在為開(kāi)發(fā)天然產(chǎn)物作為新型抑菌劑提供理論支持。以沙門(mén)氏菌為受試菌株,測(cè)定鐵皮、疊鞘石斛提取物對(duì)沙門(mén)氏菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),通過(guò)生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)和生物膜實(shí)驗(yàn)研究提取物對(duì)沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)狀況、運(yùn)動(dòng)能力和生物膜生成能力的影響,通過(guò)HPLC分析提取物中的主要成分,通過(guò)分子對(duì)接模擬探究提取物對(duì)沙門(mén)氏菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,鐵皮石斛提取物的MIC為8 mg/mL,疊鞘石斛提取物的MIC為4 mg/mL,在亞抑菌濃度下,沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)不受影響,但運(yùn)動(dòng)能力和產(chǎn)生物膜能力均受到抑制(P<0.05),抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性,2種提取物均含有異鼠李素、金絲桃苷、槲皮素這3種單體成分,活性單體均能與LuxS蛋白相結(jié)合,提示提取物通過(guò)活性單體與受體蛋白結(jié)合來(lái)抑制致病因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑菌作用。
沙門(mén)氏菌是常見(jiàn)的腸道致病菌,常引起人、食品和動(dòng)物之間的循環(huán)感染,并呈現(xiàn)全球分布。近年來(lái)隨著抑菌劑的泛用,沙門(mén)氏菌的耐藥性和抗性問(wèn)題日趨嚴(yán)重。群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是細(xì)菌產(chǎn)生QS信號(hào)分子并釋放至胞外環(huán)境中,當(dāng)環(huán)境中的信號(hào)分子濃度達(dá)到一定閾值,就能與相應(yīng)受體蛋白結(jié)合,激活靶基因表達(dá),調(diào)控菌體的群體行為。研究表明,沙門(mén)氏菌的QS系統(tǒng)可分為3類:酰基高絲氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone, AHL)介導(dǎo)的Ⅰ型系統(tǒng)、LuxS介導(dǎo)的Ⅱ型系統(tǒng)和AI-3/Epi/NE介導(dǎo)的Ⅲ型系統(tǒng)。沙門(mén)氏菌通過(guò)SdiA(suppressor of celldivision inhibition A)受體蛋白識(shí)別外環(huán)境中其他細(xì)菌產(chǎn)生的AHL信號(hào)分子生成SdiA-AHL復(fù)合體激活rck操縱子基因座表達(dá),而rck操縱子正是沙門(mén)氏菌菌毛合成,增強(qiáng)抵抗血清抗體和生物膜形成的基因座。LuxS是一種小分子金屬酶,其作用是催化細(xì)菌活化甲基化循環(huán)的最后一步S-核糖高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為4,5-二羥基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentandione,DPD),DPD能與水反應(yīng)生成QS信號(hào)分子AI-2的前體,環(huán)境中的AI-2進(jìn)入沙門(mén)氏菌細(xì)胞后,會(huì)激活沙門(mén)氏菌的鞭毛基因和相關(guān)毒力基因的表達(dá)。AI-3由胃腸道菌群產(chǎn)生,盡管AI-3不直接依賴于LuxS合成,但是LuxS突變對(duì)AI-3的產(chǎn)生會(huì)造成影響。綜上可知沙門(mén)氏菌的QS系統(tǒng)主要由LuxS蛋白調(diào)控,沙門(mén)氏菌毒力因子的表達(dá)受QS系統(tǒng)影響。因此研究基于QS系統(tǒng)的新型沙門(mén)氏菌抑菌劑,對(duì)緩解目前沙門(mén)氏菌耐藥性和抗性嚴(yán)重的局面有積極作用。
群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitor,QSI)是在不抑制細(xì)菌正常生長(zhǎng)的條件下通過(guò)抑制QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌生理活動(dòng),從而降低細(xì)菌致病力和侵襲力的物質(zhì)。許多細(xì)菌的毒力因子(毒素、蛋白酶和免疫逃避因子)受QS系統(tǒng)的AHL信號(hào)分子調(diào)控,使得靶點(diǎn)QS開(kāi)發(fā)新型抑菌劑有望成為破除沙門(mén)氏菌對(duì)越來(lái)越多抗生素耐藥局面的方式。與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)的生物膜形成過(guò)程與受QS系統(tǒng)調(diào)控的生物發(fā)光、毒力因子合成等過(guò)程具有進(jìn)化上的相關(guān)性,靶向QS干擾旨在降低毒力并抑制生物膜,但并不殺死細(xì)菌,故而與傳統(tǒng)抗生素相比,它不會(huì)施加選擇性壓力,因此不太可能使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。近年來(lái),鑒于天然產(chǎn)物具有安全、低毒和來(lái)源廣泛的特點(diǎn),將天然產(chǎn)物作為QSI已成為研究熱點(diǎn)。研究證明植物來(lái)源的天然產(chǎn)物中發(fā)揮抗QS系統(tǒng)活性的物質(zhì)多為黃酮類化合物,而主產(chǎn)于四川、云南、貴州等地的石斛正含有多種黃酮類單體。鐵皮石斛和疊鞘石斛是主要的川產(chǎn)石斛品種,大力發(fā)展石斛種植基地是夾江縣重要的鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略,對(duì)石斛提取物功能活性的研究為進(jìn)一步探索鐵皮石斛和疊鞘石斛的市場(chǎng)價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支撐。
1 材料與設(shè)備
1.1 材料
受試菌株人腸道沙門(mén)氏菌,成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保存;鐵皮石斛干莖和疊鞘石斛干莖,夾江縣秧花石斛種植專業(yè)合作社。
1.2 試劑
瓊脂、LB肉湯培養(yǎng)基,北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸,均為L(zhǎng)C-MS級(jí),上海麥克林生化科技股份有限公司。
泳動(dòng)培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂5,葡萄糖5。
1.3 儀器
SW-CJ-1FD-Ⅱ超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BPH-9082恒溫培養(yǎng)箱,致微(廈門(mén))儀器有限公司;WMLL-125B干熱滅菌箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;1510多功能酶標(biāo)儀,德國(guó)PerkinElmer公司;5415R高速冷凍離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;SR3000系列高效液相色譜儀,安徽皖儀科技股份有限公司;丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
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