發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒構(gòu)建燈盞花發(fā)根最優(yōu)的培養(yǎng)體系（一）
為建立燈盞花的發(fā)根培養(yǎng)體系，用C58C1發(fā)根農(nóng)桿菌空菌株和攜帶目的基因的菌株轉(zhuǎn)化燈盞花葉片獲得發(fā)根，測(cè)定發(fā)根的生長(zhǎng)曲線，比較不同因素對(duì)發(fā)根生長(zhǎng)量的影響。結(jié)果表明：利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌株成功從燈盞花中誘導(dǎo)出了發(fā)根，并建立了燈盞花發(fā)根最優(yōu)的培養(yǎng)體系，其誘導(dǎo)的最佳農(nóng)桿菌菌液濃度為OD600=0.6，最佳浸染時(shí)間為10 min，最佳共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，在此條件下誘導(dǎo)率高達(dá)60%。經(jīng)PCR鑒定證明Ri質(zhì)粒的T-DNA已成功轉(zhuǎn)化燈盞花的發(fā)根。
燈盞花(Erigeronbreviscapus)又名燈盞細(xì)辛、短葶飛蓬，為菊科飛蓬屬多年生草本藥用植物，全草入藥。其主要有效成分為燈盞乙素，又名野黃芩苷。燈盞乙素具有舒張血管、改善微循環(huán)、抑制血小板及紅細(xì)胞聚集，治療冠心病、心絞痛、腎衰和高血脂癥等疾病，具多種作用。但是作為云南最有發(fā)展前景的藥物之一，卻面臨著因?yàn)E采濫挖及種質(zhì)退化導(dǎo)致資源緊缺的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，從處于代謝節(jié)點(diǎn)處的關(guān)鍵基因著手，改善燈盞花的種質(zhì)，提高燈盞花素的含量成為亟待解決的問(wèn)題。
目前，燈盞花種質(zhì)資源的改善主要依靠人工栽培馴化，馴化改善的燈盞花品種中有效成分燈盞乙素雖然可達(dá)1.053%～2.628%，但仍有很大提升空間，而且還面臨著種質(zhì)很容易退化的嚴(yán)重問(wèn)題。植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri質(zhì)粒為載體可將植物次生代謝物合成關(guān)鍵酶基因整合到植物基因組中并表達(dá)，從而達(dá)到穩(wěn)定改良植物性狀、提高次生代謝物含量的目的。發(fā)根體系具有操作過(guò)程簡(jiǎn)便，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因材料等優(yōu)勢(shì)，發(fā)展?jié)摿薮蟆?
植物次生代謝工程技術(shù)的應(yīng)用已在多種植物中取得成果，如將矮牽牛(Petuniahybrida)中黃酮代謝途徑中的查爾酮異構(gòu)酶基因CHI導(dǎo)入西紅柿中并過(guò)量表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因西紅柿中果皮黃酮醇含量提高了78倍。過(guò)量表達(dá)莨菪類(lèi)生物堿合成的關(guān)鍵酶基因PMT和H6H，成功將莨菪轉(zhuǎn)基因發(fā)根中東莨菪堿的含量提高了9倍。過(guò)表達(dá)丹參JAs合成途徑中的關(guān)鍵酶基因AOC、AOS和JMT，顯著提高了丹參發(fā)根中丹參酮ⅡA的含量。過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶基因PLR成功提高了菘藍(lán)發(fā)根中落葉松脂素的含量等。而對(duì)于燈盞花，目前尚無(wú)建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道。
本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒成功地從燈盞花葉片誘導(dǎo)出發(fā)根，初步建立了最適燈盞花發(fā)根培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步利用遺傳代謝工程手段調(diào)節(jié)燈盞花次生代謝物含量提供了可行方法，以期用此方法部分替代野生資源，減輕濫采濫挖現(xiàn)狀及解決種質(zhì)退化問(wèn)題。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1材料來(lái)源
供試燈盞花種子由西南林業(yè)大學(xué)劉江華教授提供，農(nóng)桿菌C58C1由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院保存。
1.1.2試劑
試驗(yàn)用到的HgCl2，MS、B5、YEB等培養(yǎng)基，蔗糖，瓊脂，瓊脂糖凝膠，頭孢、潮霉素、利福平等抗生素，各試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭olB、rolC基因引物由蘇州金唯智生物公司合成。PCR反應(yīng)的rTaqDNA聚合酶Mix購(gòu)自Takara生物公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1植物材料處理
燈盞花種子用0.1%升汞浸泡10 min消毒，無(wú)菌水沖洗3～5次，滅菌吸水紙吸除殘留水分。將滅菌種子播種到MS固體空白培養(yǎng)基上，置于4 000 lx、16 h日光照，25℃條件下培養(yǎng)。種子3～5 d后開(kāi)始發(fā)芽，大約15 d后長(zhǎng)出無(wú)菌實(shí)生苗，45～60 d長(zhǎng)成可供剪取葉盤(pán)的燈盞花無(wú)菌苗。
1.2.2發(fā)根農(nóng)桿菌菌株活化
取-80℃凍存的C58C1菌液，于含40 mg/L利福平(Rif)的YEB平板上劃線，28℃恒溫暗培養(yǎng)2 d。挑取單菌落于1 mL YEB(含40 mg/L Rif)液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)12～16 h。取活化的C58C1菌液200μL加入到30 mL YEB(40 mg/L Rif)液體培養(yǎng)基中28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600分別為0.4、0.6、0.8。常溫下，5 000 r/min離心10 min，去上清，分別加30 mL B5、1/2B5、1/2MS、MS(均含100μmol/L乙酰丁香酮)液體培養(yǎng)基重懸菌體，28℃，100 r/min振蕩孵育30 min，用以浸染葉盤(pán)。最后統(tǒng)計(jì)分析不同濃度的菌液對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。
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