水貂李氏桿菌的分離鑒定、生化試驗、藥敏實驗、毒力試驗——材料與方法
山東日照某水貂養殖場發生神經癥狀為主要特征的疾病，發病率較少，主要表現為食欲減退、癱瘓、有的轉圈，開始未引起注意，慢慢開始增多，按照維生素B1缺乏治療，未見效果，后來發展到神經癥狀伴隨下痢、嘔吐、腹瀉，最后死亡。畜主帶病死水貂來實驗室檢測，經細菌分離檢測、生化試驗、PCR基因擴增確診為李氏桿菌，通過藥敏試驗選擇敏感性高的藥物治療，最終控制了病情。李氏桿菌在水貂上發病較少，都是散發，一般不被重視，有的僅僅作為神經性腦炎治療，現就這次李氏桿菌的分離鑒定介紹如下。
李氏桿菌可以感染多種畜、禽、野生動物和人，是一種嚴重的人畜共患傳染病，引起多種動物的流產、敗血癥、腦膜腦炎等臨床特征，在食品安全上有重要性，李氏桿菌屬的代表是單核細胞增多性李氏桿菌，該菌是人和動物李氏桿菌病的病原體，是致死性食源性條件致病菌。李氏桿菌寄生在多種冷血動物蜱、蠅、昆蟲、魚蝦和甲殼動物體內，環境中廣泛存在于江河湖、沼澤污泥、屠宰廢棄物、飼草、墊料、肉奶蛋以及水產品中。土壤污染和攝入被污染的飼料是李氏桿菌的主要傳播媒介，青貯飼料pH值高于5.5加快李氏桿菌的繁殖，是該病傳播的主要方式，被稱為“青貯病”。李氏桿菌病在不同動物上癥狀不同，在禽類和嚙齒類發病主要癥狀是壞死性肝炎和心肌炎，單蹄獸上發病主要是呈現敗血癥，反芻獸和人類發病主要是腦炎型和流產，水貂、狐貍貉子多種毛皮動物容易患該病，主要是神經癥狀。李氏桿菌是革蘭氏陽性無芽孢小桿菌，大小0.4~0.5μm×1~2μm，常呈現V形排列，血瓊脂平板培養呈現明顯的溶血環菌落。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗菌株養殖場水貂發生疾病，主要是神經癥狀，解剖從病死貂腦內分離到一株細菌，進行一系列實驗。
1.1.2試驗動物18~22g小白鼠，購自山東大學實驗動物中心；1.5~2kg家兔，購自濟南西嶺角養殖繁育中心；1~2月齡水貂，購自濟南章丘航科特種毛皮動物養殖場。
1.1.3試驗材料藥敏片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；微量生化反應小管，購自北京陸橋技術有限責任公司；營養瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂，購自青島海博生物技術有限公司；牛血清，購自內蒙古金源康生物工程有限公司；犬瘟熱病毒抗原快速檢測試紙，購自韓國百易奧生物公司；解剖臺、剪刀、手術刀、酒精燈、載玻片、接種環、試管，實驗室常備物品。
1.1.4試驗器具生物安全柜，蘇凈安泰BSC-1600IIA2；顯微鏡，奧林巴斯CX-31；全自動樣品快速研磨儀，上海凈信科技Tiss-24；基因擴增儀，杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b)c；恒溫培養箱，三洋MCO-15AC。
1.2方法
1.2.1細菌的分離培養與鏡檢
將發病死亡水貂外表消毒，放解剖臺解剖，無菌取心血、肝臟、肺臟、腦組織進行載玻片涂片、染色、鏡檢，細菌分離時接種營養瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板、10%血清營養瓊脂平板、10%兔鮮血瓊脂平板，37℃溫箱培養24h，觀察細菌生長情況。
1.2.2細菌的生化試驗
無菌取10%血清營養瓊脂平板上生長的菌落，接種10%血清馬丁肉湯培養基，接種后37℃溫箱培養24h，取樣接種各種生化反應小管，觀察是否發酵發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、海藻糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、棉實糖、糊精、水楊苷、衛矛醇，進行甲基紅MR和VP試驗，觀察是否反應，接種后第三天觀察反應結果，有的菌緩慢發酵糖類，留樣繼續觀察至第7天，記錄結果。
1.2.3細菌的16S rRNA分子生物學鑒定
病死水貂腦組織細菌分離，接種10%血清營養瓊脂平板，37℃溫箱培養24h，取菌落接種馬丁肉湯37℃溫箱培養18h，取1ml放入1.5ml無菌的離心管中，12000r/min離心1min，棄掉上清，加入無菌水中將菌體重懸，使用振蕩器震蕩搖勻，沸水浴7min，再冰浴5min，12000r/min離心1min，上清液作為基因擴增的模板。設計寡核苷酸引物來擴增16S rRNA，使用引物如下：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,R1-5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’。PCR反應體系50μl：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/L)5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，引物(20umol/L)各1μl，模板2μl，ddH2O36.8μl，Taq酶(5U/ul)0.25μl。PCR反應條件：94℃5min；94℃1min，56℃30s，72℃1.5min，30個循環；72℃10min。取PCR產物5μl用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物送交上海基因測序公司進行測序。提交Genbank進行對比，構建系統發育樹，判定細菌的系統發育地位，16S rRNA以相似性97%為界限，以高于97%判定為該菌。
1.2.4病料PCR檢測
由于水貂發病主要是神經癥狀，懷疑腺病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒一些病毒引起的疾病。無菌取肝、脾臟、腦組織研磨，進行基因擴增，檢測是否存在腺病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒。
1.2.5犬瘟熱試紙檢測
使用犬瘟熱抗原快速檢測試紙商品試紙盒內的棉簽，取鼻液、氣管液、肺部血液在稀釋液中稀釋，滴于檢測孔內，待稀釋液流到檢測區1min后，觀察結果，C為對照，T為檢測，C出現紅色線為試紙合格，可進一步判定，T線出現紅色為犬瘟熱陽性，T線無色為犬瘟熱陰性。
1.2.6細菌的藥敏試驗
按照藥敏紙片法進行藥敏試驗，將分離菌均勻涂抹在10%血清營養瓊脂平板，把相應的頭孢喹肟、頭孢噻呋、頭孢曲松、左氧氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、壯觀霉素、強力霉素、多黏菌素、林可霉素藥敏片貼在平板上，37℃溫箱培養24h，觀察記錄抑菌圈的大小。
1.2.7細菌的毒力試驗
病死水貂腦組織細菌分離，接種10%血清營養瓊脂平板，37℃溫箱培養24h，取菌落接種馬丁肉湯37℃溫箱培養18h，培養液腹腔注射18~22g小白鼠，0.5ml/只；將菌液接種1.5~2kg家兔眼睛結膜內，1ml/只；將菌液肌肉注射1~2月齡水貂，1ml/只，接種注射后連同對照組觀察7d。
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