微生物生長曲線監測儀測定納米銀對副溶血弧菌的最小抑菌濃度（三）
2結果與討論
2.1 Ag NPs的特征
透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)表征結果顯示，本研究中合成的大部分Ag NPs接近球形，且在水中具有較好的分散性(圖2a)。隨機分析100個顆粒的粒徑(d,nm)，結果顯示，平均值為(37±5)nm(圖2b)。新制備的納米材料最大光吸收峰出現在415 nm左右(圖2c)，表現出Ag NPs的特征峰。該結果還表明，產物具有較好的形貌一致性和純度。
圖2 Ag NPs的TEM(右上角插圖：其在水中的分散液照片)(a)、粒度分布圖(b)和UV-vis光譜圖(c)
2.2 EMGA法測定結果
科研界常通過分析納米材料對微生物生長曲線的影響來推測該被分析物的抑菌效應。研究首先以河口水樣S1作為代表探討了復雜介質中Ag NPs對副溶血弧菌的作用。在河口水樣S1中，10 5 CFU/mL的副溶血弧菌急性暴露于不同濃度的Ag NPs之后，暴露混合液直接轉入預裝有LB液體培養基的檢測管中，采用EMGA法測定存活細胞的生長動力學曲線，結果如圖3a所示。
Ag NPs濃度為0時(陽性對照)，三平行實驗皆得到了重現性良好的反正弦型生長曲線，說明本實驗條件下存活細菌很多且正常、穩定地增殖與生長。當河口水中Ag NPs濃度逐漸增大時，副溶血弧菌的生長調整期隨之逐漸增加，直到出現直線型響應線(表明新陳代謝活動完全被抑制)。當生理鹽水中Ag NPs濃度≥24.0 mg/L時，在該培養時間范圍內沒有反正弦型細菌生長曲線出現，根據國際通用規則，可以認為在本實驗條件下Ag NPs對副溶血弧菌的MIC值為24.0 mg/L。為了驗證EMGA法測定納米材料抑菌活性的重現性和精密度，在一周內研究團隊3名成員采用完全相同的操作方法分別進行了3次實驗，測定了Ag NPs在河口水樣品S1中對副溶血弧菌的MIC值，得到的MIC值皆為24.0 mg/L。該結果說明EMGA法具有良好的精密度和重現性。作為對比，實驗采用BMD法和平板計數法測定了相同條件下Ag NPs對副溶血弧菌的抑制效應，結果分別見圖3b和圖3c。
圖3 EMGA法(a)、BMD法(b)和平板計數法(c)測定AgNPs在河口水中對副溶血弧菌的抑制作用
由圖3可知，BMD法和平板計數法測定的MIC值也為24.0 mg/L，說明采用EMGA法分析河口水中Ag NPs的抑菌效應時，所得數據和采用經典的BMD法和平板計數法所得數據具有良好的一致性。2.3 EMGA法性能分析實驗采用EMGA法、BMD法和平板計數法分別測定了S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8共8個河口水樣品中Ag NPs對副溶血弧菌的急性暴露影響，MIC值如表2所示。
結果表明，EMGA法測定結果和BMD與平板計數法測定的MIC值吻合性很好，基本符合(EA)達到75%；小偏差(mE)為25%，未發現大偏差(ME)，說明EMGA法測定Ag NPs對副溶血弧菌抑菌效應具有良好的準確性。
此外，EMGA法測定的MIC值往往大于或等于BMD法和平板計數法的測定結果，其原因在于自動化儀器的靈敏度高于肉眼觀察。因此，EMGA法的抑菌效應測定結論比基于肉眼判斷的結果具有更高的可靠性。Zhang等研究表明，采用OD法測定模擬河口水中納米材料對大腸桿菌(Escherichia coli)的抑制效應時，細菌生長OD-t曲線因受共存物質光學信號的干擾而波動嚴重，導致無法讀取MIC的準確值。
本研究采用BMD法和平板計數法測定河口水樣中Ag NPs的抑菌效應時也需要采用離心法除去懸浮顆粒等干擾物，否則嚴重影響MIC值的準確讀取(如圖4所示)。由于MIC值和存活微生物的培養時間具有相關性，研究中培養時間全部采用20 h。
在這種情況下，如圖5所示，采用EMGA法測定河口水樣中Ag NPs對副溶血弧菌的影響時僅需要兩步手工操作——將暴露后的混合物直接轉移到檢測管和上機測定存活細菌的生長動力學曲線，檢測總周期為1 210 min。而采用BMD法和平板計數法都需要3個步驟，檢測總周期為1 230 min。較之于經典的方法，EMGA法需要的手工操作步驟較少，意味著耗時、勞動力、費用和誤差的降低，因此具有顯著的性能優勢。
表2 EMGA法、BMD法和平板計數法測定的MIC值
注：—表示Ag NPs在0~48.0 mg/L范圍內未抑制住細菌的生長。
圖4未去除懸浮固體情況下河口水的BMD(a)和平板計數(b)結果圖像
圖5 EMGA法(上)和BMD、平板計數法(下)測定Ag NPs在河口水中抑菌效應的流程和時效示意圖
3結論
本研究建立了一種測定Ag NPs在河口水中抑菌效應的表型方法。該方法僅需要兩步手工操作：1)直接將暴露混合液加入預裝有LB液體培養基的檢測管中；2)把檢測管置入EMGA工作通道中測定存活細菌的生長動力學曲線。根據細菌生長曲線形狀即可判讀出該納米材料在河口水中對副溶血弧菌的MIC值。較之于經典的測定方法(如BMD和平板計數)，其優勢在于無需去除暴露混合液中諸如懸浮顆粒之類的復雜共存物，因此操作更簡便、勞動強度小，總周期縮短至少20 min。此外，由于手工操作步驟較少，有效地降低了主觀和客觀誤差風險。EMGA法測得的MIC值具有良好的精密度和重現性。同時，該基于傳感器識別結果的自動化方法比BMD法和平板計數法具有更高的靈敏度。本研究為準確、高效地測定納米材料在諸如河口水之類復雜介質中的環境毒理效應提供了新手段。
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