不同乙醇、乙酸、氯化鈉、濃度對(duì)小米醋發(fā)酵過程中醋酸菌生長(zhǎng)曲線的影響（三）
2.2生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
將前期分離篩選出的24株菌根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.3節(jié)進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。24株菌在接觸酶、甘油生酮、乙醇氧化、發(fā)酵葡萄糖及產(chǎn)葡萄糖實(shí)驗(yàn)中為陽(yáng)性反應(yīng)，在氧化酶、產(chǎn)水溶性色素中為陰性反應(yīng);在運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)中，除菌株SY01、SY02、SY03、SH06、GL14、GL19為陰性反應(yīng)外，其余菌株均為陽(yáng)性反應(yīng);乳酸氧化實(shí)驗(yàn)中，除菌株GL09、GL17、GL18、SZ21、RH22、XM23、XM24菌為陰性反應(yīng)外，其余菌株為陽(yáng)性;在乙酸氧化實(shí)驗(yàn)中，除菌株RH05、SH06、GL09、GL11、SY15、GL16、SZ21、RH22外，其余菌株呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。
綜合以上生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步確定24株菌為醋酸桿菌屬(Acetobacter)。
2.3定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
將前期分離篩選出的24株菌根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.4.1節(jié)進(jìn)行產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，除菌株GL09外，其他菌株均能產(chǎn)生明顯的紅褐色沉淀，說(shuō)明菌株GL09不具備產(chǎn)醋酸能力，因此鑒定該菌株不屬于醋酸桿菌屬。
注:“-”表示無(wú)紅褐色，“+”表示紅褐色不明顯，“++”表示紅褐色較明顯，“+++”表示紅褐色明顯。
2.4醋酸菌定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果
產(chǎn)酸量是反映醋酸菌的重要指標(biāo)，篩選產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的醋酸菌對(duì)提高醋醅酸度，改善傳統(tǒng)食醋工藝具有重要作用。
本研究對(duì)比24株菌的產(chǎn)酸量，以AS1.41為對(duì)照菌。由圖2可知，從小米醋發(fā)酵過程醋液、醋醅樣品中共篩選出24株菌，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11以及GL19產(chǎn)酸能力強(qiáng)，其產(chǎn)酸量分別為43.05、45.30、43.35、49.50、45.45、49.95 g/L;菌株SY03、RH04、RH05、YH08、GL10、XM12、SY15、GL16、GL17、GL18產(chǎn)酸能力適中，產(chǎn)酸量分別為38.10、38.05、31.80、35.70、38.65、32.25、38.20、38.25、39.15、38.45 g/L;菌株XM13、GL14、SZ21與對(duì)照菌株AS1.41(27g/L)相差不大，產(chǎn)酸量分別為27.50、29.85、27.60 g/L;菌株XM20、RH22、XM23、XM24產(chǎn)酸量低于對(duì)照菌株AS1.41(27g/L)，產(chǎn)酸量分別為19.2、19.05、18.9、19.5 g/L。謝錦明在陜西民間醋醅中成功篩選出一株熱帶醋酸菌(Acetobacter tropicalis)，其產(chǎn)酸量高達(dá)42g/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果共有6菌株產(chǎn)酸達(dá)到42g/L以上，與謝錦明研究結(jié)果相比，菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。
2.5醋酸菌耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.5.1耐乙醇能力分析
通過前期產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)，共篩選出6株優(yōu)良菌株，分析其乙醇耐受性。結(jié)果如圖3所示，乙醇從3%增加至11.0%過程中，各菌株生長(zhǎng)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而產(chǎn)酸量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。菌株AS1.41、SY01、YH07、GL11在3%乙醇時(shí)測(cè)得最大產(chǎn)酸量，其中AS1.41產(chǎn)酸為23.9g/L;菌株SY02、SH06、GL19在5%乙醇時(shí)生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量較好，其中SY02產(chǎn)酸量最高，可達(dá)38g/L。當(dāng)乙醇增至7%時(shí)，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11、GL19及對(duì)照菌生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量呈下降趨勢(shì)，此時(shí)SY02產(chǎn)酸量最高為18.3g/L，而AS1.41產(chǎn)酸為9.6g/L。當(dāng)乙醇增至7%~9%時(shí)，菌株SY02、SH06、GL19生長(zhǎng)量仍分別為0.690、0.485、0.689，而其余4株菌生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量均受到明顯影響，對(duì)照菌AS1.41停止產(chǎn)酸。因?yàn)橐掖加幸种萍?xì)菌生長(zhǎng)的作用，所以當(dāng)初始乙醇添加量達(dá)到醋酸菌耐受臨界點(diǎn)時(shí)，菌種的生長(zhǎng)變化慢，導(dǎo)致其產(chǎn)酸下降甚至停止。通過對(duì)比可知，菌株SY01、SY02、SH06在高濃度乙醇下生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量?jī)?yōu)于其他4菌株，擁有較好的乙醇耐受性。
2.5.2耐氯化鈉能力分析
通過前期產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)，共篩選出6株優(yōu)良菌株，分析其氯化鈉耐受性。結(jié)果如圖4所示，氯化鈉質(zhì)量濃度從2g/L增至6g/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酸量基本不受影響;從4g/L增至8g/L時(shí)，對(duì)照菌生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì);在質(zhì)量濃度為10g/L時(shí)幾乎停止產(chǎn)酸;從2g/L增至6g/L時(shí)，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11及GL19生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量受到較小影響;從6g/L增至10g/L時(shí)，菌株SY02、SH06、GL19生長(zhǎng)量仍分別0.571、0.724、0.706，產(chǎn)酸量分別為12.60、13.80、17.84 g/L，而菌株SY01、YH07、GL11生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，謝錦明等研究發(fā)現(xiàn)，醋酸菌在氯化鈉濃度較低時(shí)仍可以生長(zhǎng)，但隨著濃度增加生長(zhǎng)會(huì)受到嚴(yán)重抑制，影響其產(chǎn)酸能力。總的來(lái)看，氯化鈉對(duì)菌株SY01、YH07、GL11生長(zhǎng)影響較大，因此在培養(yǎng)時(shí)，氯化鈉盡量控制在6g/L以內(nèi)，保證菌株能較好產(chǎn)酸及生長(zhǎng)。通過比較可知，在一系列氯化鈉濃度下，菌株SY02、SH06、GL19生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量能力優(yōu)于其他菌，擁有較好的氯化鈉耐受性。
2.5.3耐乙酸能力分析
通過前期產(chǎn)酸定量實(shí)驗(yàn)，共篩選出6株優(yōu)良菌株，分析其乙酸耐受性。結(jié)果如圖5所示，隨著乙酸濃度不斷增加，7株菌產(chǎn)酸量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙酸為2.0%時(shí)，GL11、GL19及對(duì)照菌產(chǎn)酸量達(dá)到最大，其中GL19及對(duì)照菌產(chǎn)酸量分別為42.90、28.95 g/L;當(dāng)乙酸為3.0%時(shí)，菌株SY01、SY02、SH06、YH07產(chǎn)酸量達(dá)到最大，其中SY02產(chǎn)酸量最高為40.80g/L，而對(duì)照菌產(chǎn)酸量為24.60g/L;當(dāng)乙酸從2.0%增至3.0%時(shí)，所有菌生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量受到較小影響，當(dāng)乙酸為4.0%時(shí)，菌株YH07、GL11及對(duì)照菌生長(zhǎng)量受到明顯抑制，而SY01、SY02、SH06、GL19生長(zhǎng)量分別為0.531、0.471、0.435、0.450，產(chǎn)酸量仍達(dá)到23 g/L以上，當(dāng)乙酸為5.0%時(shí)，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL19產(chǎn)酸量低于13g/L。因?yàn)檫^酸環(huán)境會(huì)影響醋酸菌生長(zhǎng)，而醋酸菌產(chǎn)酸能力也與其機(jī)體內(nèi)的酶有關(guān)，過酸和堿性的環(huán)境都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)酶活力降低，從而影響醋酸菌產(chǎn)酸能力。通過對(duì)比可知，菌種SY01、SY02、SH06、GL19在乙酸存在下生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量?jī)?yōu)于其他菌株，擁有較好的耐乙酸能力。
綜合以上耐受性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株SY02、SH06、GL19的耐醇、耐氯化鈉、耐酸能力較強(qiáng)，具體表現(xiàn)為:乙醇耐受可達(dá)9.0%，氯化鈉耐受可達(dá)10g/L，乙酸耐受可達(dá)4.0%。因此確定菌株SY02、SH06、GL19為目標(biāo)菌株，用于后續(xù)研究。
2.6生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果
實(shí)驗(yàn)篩選3株耐受性較強(qiáng)的菌株SY02、SH06和GL19，測(cè)定其生物量和生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖6所示，菌株SY02和SH06的活菌數(shù)及OD???值最大分別為1.755、0.967，36~48h處于穩(wěn)定期，48h后活菌數(shù)開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，逐漸進(jìn)入衰亡期。菌株GL19的活菌數(shù)和OD值均在24~48h生長(zhǎng)繁殖速度快，處于對(duì)數(shù)期，菌體最大濃度分別為6.87 lg CFU/mL，48~60h處于穩(wěn)定期，60h后活菌數(shù)逐漸進(jìn)入衰亡期。醋酸菌SY02、SH06、GL19都能在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在這個(gè)階段，菌體以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，對(duì)外界環(huán)境具有強(qiáng)大的抵抗力。
2.7分子生物學(xué)鑒定結(jié)果
2.7.1核苷酸序列分析
將菌株SY02、SH06及GL19的16S rDNA序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表3，對(duì)比發(fā)現(xiàn)3株菌株與序列號(hào)為NR_178820.1的A.pasteurianus同源性最高，相似度分別為99.50%、99.8%及99.78%。因而可確定篩選出來(lái)的3株菌均屬于巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)。
3結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)固態(tài)小米醋的醋液及醋醅中篩選得到24株菌，經(jīng)定性實(shí)驗(yàn)、耐受性實(shí)驗(yàn)等篩選出3株產(chǎn)酸能力達(dá)到43g/L以上，能耐受9%乙醇、10g/L氯化鈉和4.0%乙酸的優(yōu)良醋酸菌;經(jīng)分子生物學(xué)鑒定這3株菌均為巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurians)。
由于實(shí)驗(yàn)采用的是固態(tài)發(fā)酵過程中的醋醅及醋液，篩選出來(lái)的菌種在原醋醅中占比不高，未開展接種強(qiáng)化發(fā)酵應(yīng)用，后期可將篩選出來(lái)的優(yōu)良醋酸菌強(qiáng)化應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，研究醋酸菌在醋酸發(fā)酵階段的微生物群落變化以及對(duì)風(fēng)味形成機(jī)制的影響。
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