呼寧散對雞肺源大腸桿菌生長曲線、細胞壁的影響及抑制效果——摘要
摘要
本試驗旨在研究中藥復(fù)方呼寧散對雞肺源大腸桿菌的抑菌活性，以及對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的雞胚成纖維細胞(DF-1)損傷模型的抗炎和抗氧化作用。以桑白皮、黃芩、蒲公英、甘草等10味中藥制備中藥復(fù)方呼寧散，牛津杯法測定呼寧散對雞肺源大腸桿菌的抑菌效果，TTC法測定其最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)，繪制細菌生長曲線，檢測細菌培養(yǎng)液中堿性磷酸酶(AKP)、核酸和可溶性蛋白的含量。CCK-8法檢測LPS和呼寧散對DF-1細胞的毒性，建立LPS誘導(dǎo)的DF-1細胞損傷模型并給藥，ELISA法測定炎癥因子白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8的含量，Western blot法測定TLR4/NF-κB信號通路中Toll樣受體4(TLR4)和核因子-κB p65(NF-κB p65)關(guān)鍵蛋白表達量，相關(guān)試劑盒測定細胞內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)活性，Western blot法測定Keap1/Nrf2信號通路中Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Keap1)和核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)關(guān)鍵蛋白表達量。結(jié)果顯示：雞肺源大腸桿菌對呼寧散呈中度敏感，且MIC為250 mg·mL-1，MBC為500 mg·mL-1；呼寧散可抑制雞肺源大腸桿菌的生長，提高細菌培養(yǎng)液中AKP、可溶性蛋白和核酸含量。在細胞試驗中，呼寧散可降低LPS誘導(dǎo)的DF-1細胞上清液中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量，抑制TLR4、NF-κB p65蛋白的過度表達；呼寧散可降低LPS誘導(dǎo)的DF-1細胞ROS和MDA的含量，提高SOD活性和GSH含量，進一步提高Nrf2、NQO1、HO-1蛋白的表達量，抑制Keap1蛋白的過度表達。中藥復(fù)方呼寧散對雞肺源大腸桿菌具有良好的抑菌活性，并且可通過調(diào)控TLR4/NF-κB和Keap1/Nrf2信號通路關(guān)鍵蛋白的表達對LPS誘導(dǎo)的DF-1細胞損傷發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。
隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)規(guī)模化的發(fā)展，高密度的飼養(yǎng)條件使雞更易受到多種病原體感染，造成雞呼吸道疾病頻發(fā)。雞呼吸道疾病綜合征又稱多因素呼吸道病，主要由細菌、病毒、支原體這三大類病原體出現(xiàn)兩種及以上混合感染所致。臨床表現(xiàn)主要以呼吸道癥狀為主，如呼吸異常、咳嗽和流鼻涕等，伴有腹瀉等其它癥狀。大腸桿菌作為感染率最高的呼吸道細菌性病原體，發(fā)病率較高，通常由呼吸道開始入侵，損害氣管及肺部，極易與其他的病原體混合感染引起雞呼吸道疾病綜合征，嚴重危害雞生長性能，甚至導(dǎo)致死亡，給雞養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。因此，控制大腸桿菌感染對于防控雞呼吸道疾病綜合征具有十分重要的意義。目前，獸醫(yī)臨床多采用抗生素治療大腸桿菌感染，然而抗生素的濫用或不合理使用使得大腸桿菌耐藥增強，而且抗生素殘留也對動物源性食品安全和人類健康造成了嚴重的威脅。作為世界第一養(yǎng)殖大國，我國正踏上畜牧業(yè)綠色發(fā)展與健康產(chǎn)業(yè)密切結(jié)合的進程，中藥的應(yīng)用為養(yǎng)殖端減抗產(chǎn)品的研發(fā)開辟了一條新的路徑。
中藥具有來源豐富、毒副作用小等優(yōu)勢，日益受到國內(nèi)外畜牧獸醫(yī)工作者的廣泛關(guān)注。研究表明，多種中藥提取物及中藥復(fù)方對于大腸桿菌感染具有顯著療效。中獸醫(yī)藥講究辨證論治，雞大腸桿菌感染可辨為濕熱證，細菌侵襲機體引發(fā)的雞呼吸道疾病綜合征在中獸醫(yī)歸于“上感”范疇。外邪入侵，濕熱滯凝，致使肺氣不宣，喉癢咳嗽，治療原則主要是潤肺益氣、抗菌消炎、清熱解毒、增強機體免疫力。
本研究依據(jù)辯證施治基本原則，在《中國獸藥典》記載的藥材中進行篩選，根據(jù)“君臣佐使”原則進行合理組方并命名為“呼寧散”：其中，桑白皮為君藥主攻肺疾，瀉肺平喘、清肺降火、潤肺益氣；黃芩等臣藥起止咳作用，抗菌消炎以輔助君藥加強藥效；蒲公英等佐藥具有清熱解毒、增強免疫之功效；甘草等使藥負責調(diào)和諸藥，和中緩急，緩解藥物毒性、烈性，補脾益氣。實驗室前期已研究表明該方在10 g·kg-1及以下劑量無毒性作用，安全性好。為明確呼寧散對雞肺源大腸桿菌的抑菌活性及體外抗炎、抗氧化作用，本研究以呼寧散為試驗藥物，通過抑菌試驗及體外細胞試驗進行探討，給臨床用于防治雞呼吸道疾病綜合征的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)，促進禽類養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展。
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