呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞壁的影響及抑制效果——討論、結(jié)論
3討論
雞呼吸道疾病綜合征的病原體復(fù)雜多樣，大腸桿菌是該病最常見(jiàn)的細(xì)菌性病原體之一。雞大腸桿菌感染在中獸醫(yī)上屬濕熱證，其感染所致的雞呼吸道疾病綜合征在中獸醫(yī)被歸類于“上感”癥狀的范疇，治療時(shí)應(yīng)著重于瀉肺平喘、恢復(fù)肺氣的暢達(dá)與宣降、消炎抑菌、清熱解毒及增強(qiáng)免疫力等。因此，本試驗(yàn)在該病的中獸醫(yī)病因分析基礎(chǔ)上，根據(jù)“辨證施治”基本原則，篩選出桑白皮、黃芩、蒲公英、甘草等10味中草藥，按照“君臣佐使”配伍原則進(jìn)行了合理組方。便攜的中藥劑型在當(dāng)前中獸藥市場(chǎng)更受消費(fèi)者青睞，本研究將方中藥材依次進(jìn)行浸泡、煎煮得到湯劑，再通過(guò)濃縮、凍干、粉碎后得到呼寧散，在不改變藥效的前提下，改變了湯劑的物理性狀，可延長(zhǎng)中藥的保質(zhì)期，且方便攜帶、保存和使用。
抑菌試驗(yàn)結(jié)果是抗菌藥物最基本的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，常用的方法有紙片擴(kuò)散法、牛津杯法、二倍稀釋法及TTC法等。在抑菌試驗(yàn)中MIC和MBC是重要指標(biāo)，能抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的最低藥物稀釋度為該藥的MIC，能夠殺滅試驗(yàn)菌的最低藥物稀釋度為該藥的MBC。同時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)情況可以通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了解。高瑞芳等通過(guò)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線檢測(cè)到香青蘭提取物對(duì)大腸桿菌具有抑菌活性。本試驗(yàn)選用的牛津杯法結(jié)果顯示雞肺源大腸桿菌對(duì)呼寧散中度敏感，TTC法測(cè)得呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌的MIC為250 mg·mL-1，MBC為500 mg·mL-1，且細(xì)菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果也顯示呼寧散在0~24 h內(nèi)均可抑制該菌株的生長(zhǎng)，表明呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌具有顯著的抑制效果。
細(xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間存在AKP，當(dāng)細(xì)胞壁受到破壞后，AKP會(huì)由胞內(nèi)泄漏到胞外，可以通過(guò)檢測(cè)胞外AKP含量(或活性)以確定細(xì)胞壁的完整性。正常情況下蛋白質(zhì)、核酸等大分子無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜屏障，當(dāng)細(xì)胞膜通透性受到破壞時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)外溢會(huì)導(dǎo)致胞外蛋白、核酸濃度升高，不利于細(xì)菌成長(zhǎng)。劉琳等通過(guò)電導(dǎo)率檢測(cè)儀檢測(cè)到石榴皮水提物作用于大腸桿菌3 h后，菌液中AKP含量顯著增加，表明石榴皮水提物能破壞大腸桿菌細(xì)胞壁。Wang等采用酶標(biāo)儀檢測(cè)大腸桿菌核酸的外滲水平，結(jié)果顯示細(xì)菌紫外吸收率顯著增加，證明野胡麻破壞了大腸桿菌的細(xì)胞膜完整性。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)雞肺源大腸桿菌培養(yǎng)液中AKP活性、可溶性蛋白及核酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呼寧散作用于細(xì)菌12 h時(shí)，1/2 MIC組和MIC組培養(yǎng)液中AKP、可溶性蛋白及核酸含量均顯著增加，表明呼寧散可破壞雞肺源大腸桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而發(fā)揮抑菌作用。
LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，也是病原菌最為重要的模式分子，可誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，激活細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子，從而引起一系列的病變，常用來(lái)代替大腸桿菌誘導(dǎo)炎癥動(dòng)物或細(xì)胞模型。DF-1細(xì)胞為可傳代的雞成纖維細(xì)胞系常用以研究禽類病原體對(duì)細(xì)胞的損傷，因此本試驗(yàn)選取LPS誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞模型來(lái)探究呼寧散的體外抗炎和抗氧化作用。CCK-8溶液中的WST-8在電子耦合試劑存在時(shí)，可被細(xì)胞中的脫氫酶還原為黃色，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系，因此本試驗(yàn)利用這一特性進(jìn)行細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性測(cè)定，確定了呼寧散低、中、高劑量組的給藥濃度分別為1.5、2、2.5 mg·mL-1，LPS誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞損傷的建模濃度為40 mg·mL-1，為后續(xù)體外試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
TLR4/NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。LPS與TLR4配體結(jié)合激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等分泌，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。IL-1β大量產(chǎn)生于炎癥初期，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。IL-6是促炎因子，能與靶細(xì)胞表面IL-6受體結(jié)合成復(fù)合物，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-8也是常見(jiàn)的促炎因子，參與炎癥感染時(shí)各種細(xì)胞的相互作用。大量研究表明，中藥能夠通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路中的炎癥因子從而緩解炎癥狀態(tài)。本試驗(yàn)通過(guò)ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6和IL-8的含量，進(jìn)一步地通過(guò)Western blot法測(cè)定TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白TLR4、NF-κB p65的表達(dá)量，結(jié)果證實(shí)呼寧散可通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制炎癥因子的過(guò)度分泌，從而減輕LPS誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
體內(nèi)感染通常會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致平衡傾向于過(guò)氧化狀態(tài)。研究表明，LPS可通過(guò)激活促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。當(dāng)ROS過(guò)量時(shí)，多余的ROS會(huì)攻擊體內(nèi)組織，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和衰老。MDA是膜脂過(guò)氧化重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷，是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。SOD是機(jī)體內(nèi)天然自由基消除劑，能催化機(jī)體內(nèi)超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，是檢測(cè)抗氧化能力的指標(biāo)之一。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)，排泄出體外，反映了組織抵抗氧化損傷的能力。Wang等研究表明，LPS可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起雞肝臟細(xì)胞變性和壞死，增加體內(nèi)ROS和MDA的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟發(fā)生氧化損傷。本試驗(yàn)通過(guò)相關(guān)試劑盒檢測(cè)ROS、MDA、SOD、GSH含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呼寧散可降低DF-1細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS和MDA的含量，提高抗氧化物SOD和GSH的水平。Keap1/Nrf2通路是抵御氧化應(yīng)激的主要防御機(jī)制，Nrf2是一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過(guò)調(diào)控下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)抗氧化酶的生成，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞或機(jī)體的抗氧化能力。正常情況下Nrf2與Keap1相結(jié)合，氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2與Keap1解離而活化，進(jìn)一步激活下游抗氧化基因和細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，主要包括HO-1、NQO1、GSH等。本試驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)Western blot法測(cè)定了Keap1/Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呼寧散可明顯降低Keap1蛋白表達(dá)量，上調(diào)Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量，表明呼寧散可通過(guò)調(diào)控Keap1/Nrf2信號(hào)通路提高DF-1細(xì)胞的抗氧化能力，從而有效緩解LPS所致的氧化損傷。
4結(jié)論
呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌具有良好的抑菌活性，并且可通過(guò)調(diào)控LPS誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞TLR4/NF-κB、Keap1/Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、抗氧化能力，為臨床用于防治雞肺源大腸桿菌及雞呼吸道疾病綜合征藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
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