耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌生長曲線測定及對線蟲毒力作用（一）
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是自然界中常見的革蘭氏陰性腸桿菌，主要分布于人體內胃腸道和鼻咽部的正常寄居菌群。當其生態位發生改變或者人體免疫力降低時，可引起肺炎、下尿路感染、菌血癥等嚴重的感染性疾病，是社區和院內感染最常見的機會致病菌之一;尤其對于ICU患者、有手術治療史及接受氣管插管等創傷性操作史的患者，肺炎克雷伯菌感染將帶來致命性的后果。然而，隨著抗生素的不合理使用，肺炎克雷伯菌對多種抗生素的耐藥性正逐年增加，2017年曾倩倩等的回顧性調查發現，肺炎克雷伯菌對頭孢吡肟、阿米卡星、頭霉素等各類常用抗生素的耐藥率也呈不同程度上升，使得碳青霉烯類抗生素成為了對抗肺炎克雷伯菌的最后一道防線。
近十年來耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)的檢出率呈逐年上升趨勢。這將給臨床感染的治療及控制帶來巨大的挑戰。有研究報導，我國目前流行的CRKP主要為CG258(Clonal group)克隆的ST11型菌株，占我國CRKP的60%。CRKP的耐藥性主要通過菌體產生碳青霉烯酶水解抗生素所賦予，碳青霉烯酶基因通常由CRKP的大型耐藥質粒攜帶，常見的類型包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM及blaIMP等。Bedhomme等研究表明大型耐藥質粒的攜帶會帶來差異適應性。
由于質粒的運輸成本，所以會造成宿主菌適應性的降低，除此之外適應性還與攜帶耐藥基因的質粒拷貝數相關。Newbury等研究也證實了細菌長期暴露于抗生素環境中可能會增加質粒-宿主之間的連接性，其所攜帶的多個質粒之間會存在互利或拮抗的相互作用。雖然攜帶耐藥基因的大型質粒能為宿主菌帶來抗生素耐藥性，但如此大型的質粒對宿主菌更廣泛的適應性效應及毒力影響尚不明確。本研究主要通過探究攜帶不同耐藥基因的質粒以及攜帶單個或多個耐藥基因的質粒對CRKP環境適應性及毒力作用的影響，以期對臨床CRKP的感染控制與治療提供重要的理論依據和用藥指導。
1材料與方法
1.1材料
①細菌及線蟲:收集2011年～2015年昆明醫科大學第二附屬醫院CRKP臨床分離株共10株。N2野生型秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，C.elegans)、大腸桿菌E.coli OP50、肺炎克雷伯菌質控菌株ATCC10031、肺炎克雷伯菌ATCC700603均購自American Type Culture Collection，ATCC(https://www.atcc.org/)。②培養基:NGM線蟲培養基配方(1L):NaCl 3 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂17 g，膽固醇(5 mg/mL，無水乙醇配置，過濾除菌)1 mL，高壓滅菌后加入過濾除菌的1 M CaCl21 mL，1 M MgSO41 mL，1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)10 mL倒入平板，過夜晾干后加適量E.coli OP50單克隆菌液制成NGM發育板上，加適量CRKP分離株的單克隆菌液制成NGM檢測板備用;LB液體及固體培養基按常規方法配置。③主要試劑及緩沖液:M9緩沖液(1 L):七水磷酸氫二鈉5.8 g，磷酸二氫鈉3.0 g，氯化鈉5.0 g，七水硫酸鎂0.25 g，添加ddH2O至1 L，高壓蒸汽滅菌備用;線蟲Bleach裂解液(100 mL體系):5 M NaOH 10 mL，次氯酸鈉20 mL(5%有效氯含量)，ddH2O 70 mL，4℃避光儲存備用;1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0):KH2PO4117.3 g，K2HPO424.0 g，添加ddH2O至1 L，高壓滅菌備用;線蟲凍存液(1 L):NaCl 5.85 g，KH2PO46.80 g，甘油300 mL，1 M NaOH 5.60 mL，滅菌后加入0.3 mL無菌1M MgSO4備用。
1.2細菌耐藥基因型鑒定
根據檢驗科VITEK平臺的藥敏及菌種鑒定結果，收集昆明醫科大學第二附屬醫院CRKP臨床分離株10株，根據《全國臨床檢驗規程》對菌株進行分離、純化、保菌備用。采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，利用PCR技術對碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP，β-內酰胺類耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、blaLAP進行擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，隨后對陽性條帶進行測序、Blastn比對分析。肺炎克雷伯菌ATCC10031、ATCC700603作為對照菌株。見表1。
表1各耐藥基因PCR引物
1.3菌種鑒定及MLST分型
擴增16S rRNA基因，sanger雙向測序后進行Blastn比對分析，鑒定菌種;PCR擴增七個管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)，sanger雙向測序后通過等位基因數據庫比對鑒定其ST類型(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)。
1.4細菌生長曲線測定
分離純化后的菌株從-80℃取出，接種于5 mL未添加亞胺培南抗生素的LB液體培養基中，200 rpm，37℃搖菌復蘇培養4 h。將復蘇后的細菌在無抗性LB平板上劃線過夜培養，挑取單克隆菌落在5 mL無抗LB液體培養基中增殖培養8～12 h，待細菌進入指數生長期后，用無菌PBS稀釋菌液至OD600=0.1(MCF=0.13～0.14)，取稀釋后的菌液50μL接種至加有5 mL LB液體培養基的濁度瓶中，加入亞胺培南抗生素，濃度分別為:0、2和8 mg/mL，200 rpm，37℃搖菌培養。測定濁度瓶初始MCF值，之后每隔30 min測定一次MCF值，連續測定24 h。每個分離株的各抗生素濃度組平行培養2瓶，整體實驗重復兩次。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制生長曲線，采用Kruskal-Wallis檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析，P<0.05為差異具有統計學意義。
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