副溶血弧菌活菌計數(shù)方法：MTT比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長曲線法（二）
1材料與方法
1.1細菌
實驗用副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的編號為20130629002S01(以下簡稱2S01)，取自中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學研究室(王娜等,2016;Dong et al,2017)。將凍存的2S01菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)平板上劃線，28℃培養(yǎng)12 h，挑取單個菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中，于28℃以110 r/min過夜振蕩培養(yǎng)，3000 r/min離心10 min，并用磷酸緩沖溶液(PBS)清洗沉淀、重懸，調(diào)整其OD600 nm=0.5，經(jīng)平板計數(shù)方法檢測其濃度約為1.12×108 CFU/ml。取2 ml接種于200 ml TSB培養(yǎng)基中，在28℃以110 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)4~6 h，待細菌剛達到指數(shù)生長期時，用冷凍離心機4℃離心3次，并用PBS溶液清洗沉淀、重懸，調(diào)整其OD600 nm=0.5，備用。
1.2 MTT比色法
1.2.1檢測波長確定
將100μl重懸菌液加入96孔細胞培養(yǎng)板(Corning,美國)，然后每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT溶液(溶于PBS溶液并經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌)(Solarbio)，用微孔板振蕩儀混勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h，取出后于4000 r/min離心10 min，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO(Solarbio,中國)，振蕩混勻10 min，設定Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(Thermo,美國)波長在400~700 nm范圍內(nèi)進行波長掃描，只加DMSO作為空白對照組，每組3個平行。
1.2.2 MTT溶液的使用劑量
在相同量的菌液中分別加入終濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/ml的MTT溶液，充分反應后離心，棄上清液，每組3個平行，按MTT比色法的步驟測量各組OD值。
1.2.3干擾物質(zhì)的影響
以DMSO為參比，以PBS溶液和121℃滅菌20 min的死亡菌體為樣品，用MTT法測量，每組3個平行。
1.2.4 MTT溶液與菌液反應時間
分別將MTT法的37℃孵育反應經(jīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后，離心棄上清液，終止反應，每組3個平行，按上述方法測量各組OD值。
1.2.5檢測范圍與標準曲線
將濃度為1×109 CFU/ml的菌懸液按2倍濃度梯度依次稀釋為9.77×105~1×109 CFU/ml，每組3個平行，用MTT法測量各組OD值，用SigmaPlot 12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用Polynomial進行線性分析，建立菌液濃度與其反應后OD值的標準曲線。
1.3 ATP生物發(fā)光法
1.3.1試劑盒可靠性檢測
按增強型ATP檢測試劑盒(Beyotime)說明書操作步驟用試劑盒提供的ATP標準品進行試劑盒驗證，并建立標準曲線。
1.3.2檢測范圍與標準曲線
將調(diào)整OD后的菌液稀釋成濃度為3×103、1×104、3×104、1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109 CFU/ml的菌懸液，然后按照試劑盒說明書測量各組相對發(fā)光度值(RLU)，每組3個平行，建立菌液濃度與其反應后RLU的標準曲線。
1.4高通量生長曲線法
1.4.1不同濃度菌液連續(xù)培養(yǎng)進行OD值測定
將調(diào)整OD后的菌液稀釋成1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 CFU/ml的菌懸液，每個梯度取2μl，用8通道移液器加至預先加有198μl TSB培養(yǎng)基的96孔板中，每個濃度3個重復，設置PBS空白對照，用渦旋振蕩儀混勻，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱，300 r/min振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 h測定OD600 nm。
1.4.2建立標準曲線
將細菌培養(yǎng)時間和OD600 nm的讀數(shù)扣除未接種細菌的培養(yǎng)基孔的OD600 nm值，用SigmaPlot 12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，按Sigmoid曲線類型用3參數(shù)模式擬合，根據(jù)擬合出的方程，統(tǒng)計其各組菌液生長曲線達到a/2值的時間x0，建立菌液濃度與該時間的標準曲線。
1.5副溶血弧菌菌液的測量
取10份不同濃度的副溶血弧菌菌液，分別用3種計數(shù)方法與平板計數(shù)法進行對比，分析3種計數(shù)方法的計數(shù)結(jié)果(C)與平板計數(shù)法的計數(shù)結(jié)果(CP)的線性關系和變異系數(shù)(C.V.)。
C.V.=(C–CP )/CP ×100%
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