耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌生長曲線測定及對線蟲毒力作用（二）
1.5線蟲侵染實(shí)驗(yàn)
1.5.1線蟲復(fù)蘇及同步化取凍存的線蟲室溫融化，用10 mL M9緩沖液洗滌，靜置后棄上清液。將線蟲沉淀加入到含有E.coli OP50的NGM發(fā)育板上，20℃培養(yǎng)2～3 d，期間顯微鏡下觀察線蟲發(fā)育情況、密度及產(chǎn)卵情況，直到平板上有大量蟲卵或者線蟲體內(nèi)有大量蟲卵。用3 mL M9緩沖液將線蟲及蟲卵從平板上沖洗下來，得到的混懸液裝到15 mL離心管，離心棄上清。用5 mL M9緩沖液洗滌、離心、棄上清，盡量將細(xì)菌洗凈，剩余沉淀即為線蟲和蟲卵。加入2倍體積的線蟲裂解液，劇烈漩渦震蕩5 min直至液體變得清亮，離心棄上清。此時剩下的沉淀為蟲卵，加入10 mL M9緩沖液重懸蟲卵，離心棄上清，重復(fù)兩次，以去除殘余的線蟲裂解液。再加入1 mL M9緩沖液重懸蟲卵，吸取1～2μL蟲卵液至載玻片上推開，在顯微鏡下觀察蟲卵數(shù)量及裂解效果，將重懸后的蟲卵傾斜放置于20℃培養(yǎng)箱孵化，16 h后得到同步化的線蟲幼蟲。將線蟲幼蟲加入NGM發(fā)育板中，20℃培養(yǎng)45～54 h得到同步化的線蟲成蟲。
1.5.2線蟲侵染
在NGM培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L的氟尿苷(Floxuridine，F(xiàn)UDR)以抑制線蟲繁殖，倒板，取過夜培養(yǎng)的單克隆菌液用M9緩沖液稀釋25倍后鋪至無抗生素的NGM平板，配置成NGM檢測板，對照組采用肺炎克雷伯菌ATCC10031和ATCC700603菌株配置。將同步化的線蟲成蟲用M9緩沖液從發(fā)育板上洗脫下來，離心棄上清，加入適量M9緩沖液重懸，取適量重懸后的線蟲加到NGM檢測板及NGM對照板上，在體式解剖鏡下計數(shù)線蟲數(shù)量，控制每個平板線蟲數(shù)為(50±5)條，每個分離株做兩個平行檢測板，整體實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
1.5.3繪制線蟲生存曲線
每天同一時間段在顯微鏡下觀察線蟲的存活情況，記錄每日死亡數(shù)量，線蟲死亡的判定標(biāo)準(zhǔn):蟲體僵直，腫脹破裂，輕輕敲打平板線蟲仍不能運(yùn)動。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制線蟲生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1細(xì)菌耐藥基因型鑒定10個分離株耐藥基因鑒定結(jié)果見圖1、表2。
圖1耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型電泳圖
表2耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型鑒定及MLST序列分型
2.2細(xì)菌菌種鑒定及ST分型
通過對10個分離株進(jìn)行16S rRNA基因驗(yàn)證，對sanger測序結(jié)果進(jìn)行Blastn比對，確認(rèn)10個分離株均為肺炎克雷伯菌;對七個管家基因PCR擴(kuò)增后測序，MLST等位基因比對后，得到5種ST類型，其中ST-11型和ST-290型各三株、ST-395型兩株、ST-340型和ST-437型各一株。見表2。
2.3菌株生長曲線
根據(jù)碳青霉烯類耐藥基因鑒定結(jié)果，對分離株進(jìn)行分組(表3)，繪制生長曲線。在沒有抗生素壓力下，各組菌株生長趨勢基本一致，在2～5 h處于指數(shù)生長期，細(xì)菌生長迅速;第5～24 h生長曲線趨于穩(wěn)定，處于平臺期，體系MCF值趨于穩(wěn)定，各組生長曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2A)。在2 mg/mL亞胺培南壓力下，對照組全程未見生長，所有分離株均在4 h后才開始進(jìn)入指數(shù)生長期，6 h后進(jìn)入平臺期(圖2B)，攜帶單個耐藥基因組中blaIMP組細(xì)菌總量最低，其次為blaKPC組;攜帶雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組、blaIMP+blaOXA組細(xì)菌總量最高。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，除blaNDM組、blaOXA組與blaNDM+blaOXA組比較沒有差異，攜帶單個耐藥基因與攜帶雙耐藥基因?qū)?xì)菌的生長適應(yīng)性和細(xì)菌總量有不同的影響，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖3)。在8 mg/mL亞胺培南壓力下，對照組全程未見生長，其余各組菌株表現(xiàn)出不同程度的適應(yīng)性差異(圖2C)。其中blaKPC組、blaKPC+blaNDM組最快進(jìn)入指數(shù)生長期(4～6 h)，其次為blaNDM組，blaOXA組在第14 h才開始生長，15～17 h處于對數(shù)期;blaKPC組在從16 h開始曲線出現(xiàn)下降趨勢進(jìn)入衰亡期。細(xì)菌總量以blaKPC+blaNDM組最高，blaIMP+blaOXA組最低。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，單耐藥基因組中blaNDM組和blaIMP組適應(yīng)性強(qiáng)于blaOXA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組和blaNDM+blaOXA組分別比單耐藥基因組blaKPC和blaOXA生長適應(yīng)性強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖4。
表3根據(jù)菌株攜帶的碳青霉烯類耐藥基因分組
圖2不同抗生素濃度下各菌株的生長曲線
圖3 2 mg/mL亞胺培南培養(yǎng)基中各組細(xì)菌總量的兩兩比較
圖4 8 mg/mL亞胺培南培養(yǎng)基中各組細(xì)菌總量的兩兩比較
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