白馬耳組織成纖維細胞體外培養、冷凍前及復蘇后存活率、生長曲線繪制（二）
1.2.3烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞凍存前及復蘇后存活率測定
當細胞生長狀態良好時，按照1.2.1中細胞傳代方法得到細胞懸液，通過計數得到細胞總數。取40μl有2.0x 10個細胞的細胞懸液，按照臺盼藍染色計數說明書的染色比例加入10μl已過濾的臺盼藍染液，混勻靜置7min(劉剛等2013)，在顯微鏡下觀察并統計死細胞數目(死細胞呈藍色)，將其余細胞在液氮中凍存保存1個月后解凍，離心后獲得細胞沉淀，加入5ml培養液制得細胞懸液，并按上述染色方法進行染色，計數統計細胞總數及死細胞數。通過統計得到細胞凍存前、復蘇后細胞總數與死細胞數目，并根據以下公式計算得到凍存前、復蘇后的細胞存活率:細胞存活率=100%[(細胞總數-死細胞數)/細胞總數]。
1.2.4烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的生長曲線繪制
當細胞生長狀態良好時，按1.2.1中細胞傳代方法處理細胞以得到細胞懸液，統計細胞總數。取2.4x105個細胞，用24ml培養液混勻后制成細胞懸液。24孔細胞培養板每孔接種1.0x104個細胞，每3孔細胞為一組，共8組，將24孔細胞培養板置于37℃5%CO2培養箱培養。細胞培養24h后每天相同時間統一計數一組細胞的數目，通過計算得出對應生長天數的細胞總數:細胞總數=(細胞數/體積)x總體積x稀釋倍數。按相同方法計數8d并統計數據。根據計算得到第1至第8天對應的細胞總數，Biosense微生物生長動態監測系統自動繪制細胞生長曲線圖。依據以下公式計算烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞群體倍增時間:D_{T}=tleft[lg 2/left(lg N_{t}-lg N_{0}right)right]，式中，D_{T}為細胞倍增時間，t細胞培養時間，Nt細胞培養t時的細胞數目，N0細胞開始進入對數生長期第1天的細胞數;依據以下公式計算烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞群體倍增次數:X=(lgN2-lgN1)/lg2，式中，N1細胞接種時的細胞數目，N2細胞生長至對數期末時的數目。
通過測定不同時間烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的數量，得到細胞總數與時間的關系，據此繪制出細胞的生長曲線圖，實驗重復3次。根據實驗需要繪制每隔3代的細胞生長曲線圖(Li et al.2020)。
1.2.5烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的貼壁率測定
本實驗對烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞進行細胞貼壁率測定，以確定傳代的成纖維細胞生長、增殖狀態。在細胞生長狀態良好時，根據1.2.1中細胞傳代方法對細胞進行處理，得到細胞沉淀。1ml培養液充分混勻細胞，統計細胞總數。6孔細胞培養板每孔鋪板處理后加入2ml培養液，均勻接種2x105個細胞，重復3孔，于37℃5%CO2培養箱培養。分別在細胞培養6h、12h、24h時進行未貼壁細胞數目統計。輕晃細胞培養板后均勻吸取100μl培養液，利用血球計數板重復計數3次，按以下公式計算得細胞貼壁率，貼壁率=100%[(接種細胞數-未貼壁細胞數)/接種細胞數]。
1.2.6烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞染色體核型
選取處于生長對數期的細胞，每1ml原細胞培養液中添加5μl秋水仙素(20mg/L)，每瓶中加入25μl秋水仙素并置于37℃5%CO2培養箱中處理2.5h使細胞停在分裂中期(郭晶營等2018)。秋水仙素處理細胞結束后，棄掉培養液，按1.2.1中細胞傳代方法得到細胞沉淀。加入8mlKCl溶液(0.075mol/L)重懸細胞沉淀，充分混勻后將離心管放入37℃恒溫水浴鍋中低滲40min。在低滲結束前1min加入1ml提前預冷的固定液(甲醛與冰乙酸體積比為3:1)進行預固定。預固定結束后離心(1000r/min，10min)收集細胞沉淀。隨后在離心管中加入8ml已預冷的固定液重懸細胞沉淀，輕輕顛倒混勻后置于37℃恒溫水浴鍋中固定30min，離心(1000r/min，10min)得到細胞沉淀。該步驟重復3次。得到細胞沉淀后根據細胞量加入300~500μl固定液重懸細胞沉淀，吹打混勻。在距已預冷的載玻片垂直距離約為1.6m處使細胞懸液均勻滴落，再把載玻片放入烘箱中70℃烘干2h，室溫冷卻或室溫干燥12h。使用Giemsa染液(2.5mlGiemsa母液溶于47.5ml超純水中并過濾)染色10~15 min，沖洗掉載玻片背面浮色，自然晾干后即可在顯微鏡下觀察拍照，統計染色體數目。
2結果
2.1烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞培養形態觀察
對雄性(圖1a)和雌性(圖1b)烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞原代建系培養。雄性耳組織在培養5~6d時沿著組織塊附近新長出的紡錘形或三角形細胞，確定為成纖維細胞，也有部分細胞形態為扁平不規則多角形，視為上皮細胞。培養10~12d后，培養瓶中細胞匯合度達到60%且成纖維細胞優勢生長，在顯微鏡下觀察細胞間有空隙且呈現漩渦狀生長。培養13~15d后，培養瓶中細胞匯合度達到80%以上。雌性耳組織細胞生長速度快于雄性耳組織成纖維細胞，在3d后細胞沿組織塊周圍長出。雌性耳組織成纖維細胞形態及長勢與雄性耳組織成纖維細胞基本相同，因此，后續實驗選用成纖維細胞進行細胞傳代培養及生物學特性分析。
由于成纖維細胞與上皮細胞相比對酶消化液的敏感程度不同，用0.25%胰酶消化液處理，經傳代純化培養后，得到較純的成纖維細胞。雄性和雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞經過細胞傳代培養(圖2)，均最多培養到80代(P80)。細胞呈現三角形，隨著細胞培養代次的增加，細胞生長匯合度達到80%以上需要的時間變長，且細胞形態由立體狀三角形形態逐漸變為扁平不規則多邊形形態。兩種耳組織成纖維細胞經傳代培養到后期，雄性耳組織成纖維細胞生長明顯優于雌性耳組織成纖維細胞，且雌性耳組織成纖維細胞的形態略微扁平，整體呈現長梭形。
2.2烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞支原體檢測
細胞培養過程對環境以及操作步驟的潔凈度要求非常高，在細胞培養過程中培養物非常容易因為操作不當等原因而受到污染，從而對之后的實驗產生影響，其中，支原體污染較為普遍且不易被發現，因此選擇培養的耳組織細胞5代(P5)時進行檢測。被檢測的雄性、雌性耳組織成纖維細胞均為357bp的單一條帶，與支原體檢測陰性模板一致(圖3)，說明雄性、雌性耳組織成纖維細胞培養過程中均未受到支原體的污染。
Maker.2 000 bp DNA分子量標準;1.支原體檢測陽性模板;2.支原體檢測陰性模板;3.雄性耳組織成纖維細胞;4.雌性耳組織成纖維細胞。
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