肌苷對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質(zhì)影響——摘要、材料與方法
酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterristris）主要存在于酸性土壤及蘋果汁、番茄汁等酸性果汁中，是一種革蘭氏陽性細菌，具有嗜酸耐熱特性，好氧、無致病性，由該菌污染引起的果汁營養(yǎng)損失、風味劣變、出現(xiàn)沉淀等質(zhì)量問題已成為制約果蔬加工及出口貿(mào)易的瓶頸。據(jù)報道，35%的果汁產(chǎn)品變質(zhì)問題都是因酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染引起的。該菌在不利條件下可形成抗逆性極強的芽孢，條件適宜時芽孢便會萌發(fā)生長，產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、2，6-二溴苯酚和2，6-二氯苯酚等代謝產(chǎn)物，散發(fā)出難聞氣味并引起產(chǎn)品沉淀，是果汁加工行業(yè)比較棘手的問題。
作為果汁產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵質(zhì)量因子，關(guān)于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制研究已有30多年。在已報道的滅菌方法中，物理法控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的能源及經(jīng)濟消耗較大。高溫處理是生產(chǎn)中常用的控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的方法，熱處理雖具有殺菌時間短、滅菌效果好的優(yōu)點，但對果汁的營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)破壞嚴重。新型滅菌技術(shù)中超高壓滅菌法對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的殺滅效果較好，能較好地保存果汁產(chǎn)品的營養(yǎng)成分，然而對儀器的要求較高，經(jīng)濟耗費較大。化學法對抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌也有一定的效果，生產(chǎn)上常用苯甲酸、亞氯酸、次氯酸鈉等來抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，然而苯甲酸含有刺激性氣味，會影響果汁口感，亞氯酸在室溫下不穩(wěn)定，極易分解，在使用過程中對操作技術(shù)的要求較高。
隨著人們健康意識的增強，具有抑菌性能的天然物質(zhì)及其衍生物逐漸被開發(fā)并應用到食品工業(yè)中。有研究報道天然化合物如石榴提取物、葡萄籽提取物、胡椒提取物等對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌有一定的抑菌效果，但多數(shù)植物提取物含有葉綠素、花色素、黃酮類色素等或者具有不良氣味的揮發(fā)性氣體，而且達到生產(chǎn)要求的抑菌效果的使用劑量較大，往往會影響產(chǎn)品的色澤、口感及風味等感官品質(zhì)。因此，果汁工業(yè)急需開創(chuàng)新型高效的有利于保存果汁營養(yǎng)成分的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌控制技術(shù)。
肌苷，又稱次黃苷，屬于人體的正常成分，無色、無味，目前常用于食品加工和制藥行業(yè)。有研究發(fā)現(xiàn)，肌苷可以促進細菌芽孢的復蘇，對蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的芽孢復蘇均有促進的效果。然而，課題組在研究肌苷對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的影響時發(fā)現(xiàn)，它不僅不能促進該菌芽孢的萌發(fā)，反而能延緩其芽孢萌發(fā)并導致萌發(fā)后的營養(yǎng)菌體死亡。鑒于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有獨特的嗜酸耐熱生理特性，推測肌苷在酸性條件下對該菌可能有特異性抑菌作用。本文通過測定肌苷處理前、后的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長和生存情況，形態(tài)變化及生物膜形成能力來檢測肌苷對該菌的抑制效果，研究較好抑菌效果的肌苷添加量對橙汁酸度、糖度、色度及口感的影響，為開發(fā)控制酸性果蔬制品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的新型綠色高效抑菌劑提供參考。
1、材料與方法
1.1材料與儀器
酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterristris DSM 3922T），購于德國菌種保藏中心；肌苷、戊二醛、無水乙醇均為分析純，天津市德恩化學試劑有限公司；橙子為市售鮮果。
ZQTY-70F全溫振蕩培養(yǎng)箱；TGL-16B臺式高速離心機；ES-315全自動高壓滅菌器；H1987手持糖度折光儀；CR400便攜式色差儀；環(huán)境掃描電子顯微鏡；Varioskan LUX多功能酶標儀；MJBL80Y21美的榨汁機。
1.2培養(yǎng)基的制備
AAM液體培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g，酵母浸粉2.0 g，氯化鈣0.38 g，磷酸二氫鉀1.2 g，七水硫酸鎂1.0 g，一水硫酸錳0.38 g，硫酸銨0.4 g，加滅菌水定容至1 L，調(diào)pH值至4.0，121℃高壓滅菌15 min；
AAM固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%～1.8%的瓊脂。
1.3試驗方法
1.3.1菌株培養(yǎng)條件
將冷凍保藏的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌接種于AAM液體培養(yǎng)基中，在45℃、250 r/min條件下活化培養(yǎng)12 h，然后按1%接種量再轉(zhuǎn)接至AAM培養(yǎng)基中，45℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)。
1.3.2光密度法測定酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線
將活化12 h的菌液按1%的接種量分別接種于含肌苷濃度為0，1，5，10，20，30 mmol/L的AAM液體培養(yǎng)基中，45℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每2 h測定一次菌液吸光值（OD600nm）。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作不同濃度肌苷處理下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長曲線。
1.3.3結(jié)晶紫染色法測定生物膜形成量
采用的96孔板定量法，取20μL 106CFU/mL菌懸液置于96孔板中，每孔分別加入200μL含0，1，5，10，20，30 mmol/L肌苷濃度的AAM培養(yǎng)液。然后將96孔板置于45℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，使細菌完全附著在孔板表面。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔中加入0.01 mol/L的無菌PBS緩沖液清洗3次。待96孔板風干后，加入無水甲醇固定15 min，棄去孔中廢液后風干。然后加入1%的結(jié)晶紫溶液，置于室溫下染色15 min后，用流動去離子水洗去孔板中殘余的結(jié)晶紫染料后風干，再加入200μL 33%的冰乙酸溶液進行脫色。脫色完成后，用酶標儀測定每孔的OD600nm值，分析生物被膜形成量。
1.3.4環(huán)境掃描電子顯微鏡檢測酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌形態(tài)
將活化至對數(shù)期的菌液以1%接種量分別加入肌苷濃度為0 mmol/L和5 mmol/L的培養(yǎng)液中，45℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)6，12，18，24 h的菌液，離心收集菌體，用預冷的無菌水反復清洗3～5次，加入體積分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液，置于4℃環(huán)境下固定2 h以上。將固定好的樣品用預冷的無菌水反復清洗后，利用35%，50%，70%，80%，90%和100%體積分數(shù)的乙醇進行梯度脫水后再用無水乙醇重懸。取適量菌懸液滴加于玻片上，自然風干后噴金，利用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)。
1.3.5平板計數(shù)法測定
酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生存情況將菌體濃度為107CFU/mL的菌液分別接種至含0，1，5，10，20，30 mmol/L濃度肌苷的AAM培養(yǎng)液中，調(diào)整該菌液的初始菌濃度分別為105CFU/mL和106CFU/mL，45℃，250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h。每6 h取100μL菌液梯度稀釋后涂布于AAM固體平板上，45℃，倒置培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)，檢測酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的存活情況。
1.3.6鮮榨橙汁制備
選取成熟、飽滿的新鮮橙子，清洗干凈后加入適量純水，使用榨汁機制汁，用干凈的紗布過濾3～4次，90℃，5 min殺菌備用。
1.3.7果汁理化指標測定
在鮮榨橙汁中分別加入終濃度為0，1，5，10，20，30 mmol/L的肌苷，利用pH儀、手持式糖度折光儀、便攜式色差儀測定橙汁的酸度、糖度（可溶性固形物含量，TSS）、顏色參數(shù)等理化指標。樣品總色差計算公式為：
式中L*代表明暗度，a*代表紅綠色值，b*代表黃藍色值。
1.3.8果汁感官評定
對果汁感官鑒定的方法，制訂表1中鮮榨橙汁的評分標準，選擇10名食品專業(yè)的學生分別從氣味、色澤、口感、狀態(tài)4個方面對橙汁進行感官評價，總分為100分。
表1鮮榨橙汁的感官評分標準
1.4數(shù)據(jù)處理與分析
所有試驗重復3次，采用Origin9.0進行繪圖，運用SPSS 23軟件Duncan進行方差分析（ANOVA）（P<0.05），試驗結(jié)果以表示。
肌苷對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質(zhì)影響——摘要、材料與方法
肌苷對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質(zhì)影響——結(jié)果與分析
肌苷對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質(zhì)影響——討論與結(jié)論
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