生食大眼金槍魚中生物胺產生菌分離純化、菌落總數、生長曲線及形狀鑒定（一）
摘要：為了探究大眼金槍魚(Thunnus obesus)生魚片中生物胺產生菌的產胺特性,從市售大眼金槍魚生魚片中分離出9株生物胺產生菌的單菌落并確定其生長曲線,采用高效液相色譜法分析了菌株發酵液中生物胺的濃度。結果表明,9株菌株為嗜溫菌,適宜環境下均可產生色胺、腐胺和尸胺。篩選出3株生物胺產量較高的菌株,通過單菌落接種于TSB培養基培養,3 d累積產生生物胺的質量濃度分別為40.4、41.3和50.3 mg/L。將產胺量較高的菌株進行VITEK 2和16S r DNA鑒定,3株菌株分別為溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus),產堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。該研究結果為進一步研究如何抑制大眼金槍魚中生物胺的產生提供了理論依據,也為大眼金槍魚的保藏研究奠定了理論基礎。
大眼金槍魚(Thunnusobesus)又稱肥壯金槍魚，屬鱸形目鯖科，大洋性洄游魚類，分布于印度洋、大西洋、太平洋和南海外海等地。其肉質鮮美，營養豐富，不僅富含蛋白質，還含有DHA和EPA等不飽和脂肪酸，食用和商用價值極高。據最新國際漁業動態報道，隨著金槍魚市場價格不斷走高，捕撈量也在大幅提高。
目前，國內市售大眼金槍魚占有市場比例較高，由于其屬于紅肉魚類，在加工和流通過程當中，如果加工和貯藏不當，容易造成生物胺超標。生物胺是一種低分子量的堿性含氮化合物，廣泛存在于蛋白質及氨基酸含量豐富的水產品中，主要通過微生物產生的氨基酸脫羧酶分解游離氨基酸產生。食用生物胺超標水產品，易引起人體中毒，近些年來因食用金槍魚而發生的生物胺中毒事件時有發生。國內對于生食金槍魚已經有了相關標準，其中組胺不得超過90 mg/kg。
國內外對水產品中生物胺產生菌已經有了相關研究，常見的有弧菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、乳酸菌、腸桿菌等，除此之外一些新的菌群也被證實可產生生物胺，如沙門菌群、巴斯德菌和根瘤菌等不同菌科。目前，大眼金槍魚中生物胺產生菌的相關研究鮮有報道。本文將大眼金槍魚的生魚片作為研究對象，通過微生物分離結合高效液相色譜技術，篩選出了生物胺產生菌，再利用表型特征鑒定和基因型鑒定相結合的方法，確定了菌株的種類，以期為生食大眼金槍魚肉中生物胺的控制提供理論參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
大眼金槍魚，購于廣州市沛洋食品有限公司(-60℃凍藏)。
腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、組胺、酪胺、丹磺酰氯(純度≥98%)，美國Sigma公司；NaCl、NaOH、NaHCO3、NH3·H2O，廣州粵升化學試劑廠；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、L-組氨酸、色氨酸、酪氨酸、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(tryptic soy broth，TSB)，廣州市普博儀器有限公司；乙睛(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水，實驗室自制。
1.2儀器與設備
LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津SHINADZU公司；CX41顯微鏡，日本OLYMPUS公司；MILLI-Q超純水機，美國Millipore公司；3K30高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；SPX-500智能生化培養箱，寧波江南儀器廠；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；TU-1990紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；oCelloScope微生物生長監測系統，法國梅里埃公司；DYY-7B電泳儀，北京六一儀器廠。
1.3實驗方法
1.3.1樣品制備
將金槍魚在無菌環境下解凍后置于0℃下貯藏備用。
1.3.2菌落總數和K值的測定
參考GB4789.2—2016的方法，測定0℃貯藏的大眼金槍魚中的菌落總數。
參考SC/T 3048—2014的方法，測定0℃貯藏的大眼金槍魚中K值變化。K值計算如公式(1)所示：
式中：ATP為腺苷三磷酸濃度、ADP為腺苷二磷酸濃度、AMP為腺苷酸濃度、IMP為肌苷酸濃度、HxR為次黃嘌呤核苷濃度、Hx為次黃嘌呤濃度，單位均為μmol/g。
1.3.3培養基配制
生物胺篩選培養基(g/L)：胰蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、NaCl 5.0、CaCO31.0、瓊脂20、溴甲酚紫0.06、L-組氨酸2、色氨酸2、酪氨酸2，1 mol/L HCl調pH至5.3±0.2。
TSA培養基(g/L)：取47 g TSA于1 L蒸餾水中滅菌，制成平板培養基和斜面培養基。
TSB培養基：取TSB 3 g、L-組氨酸0.03 g、色氨酸0.03 g、酪氨酸0.03 g于100 mL蒸餾水中滅菌。
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