不同包裝方式下清蒸大黃魚貯藏過程中PH值、菌落總數、菌群等的變化情況（一）
摘要：探究不同包裝方式對清蒸大黃魚貯藏過程中品質及菌群的影響。基于理化性質及高通量測序技術測定不同包裝方式下清蒸大黃魚貯藏過程中的汁液流失率、pH值、總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應物值、揮發性成分、菌落總數和微生物群落的變化。結果表明：相比于普通包裝，真空包裝和氣調包裝均可有效抑制清蒸大黃魚貯藏過程中TVB-N含量的上升，真空包裝可以最大程度抑制貯藏過程中清蒸大黃魚的脂質氧化，而氣調包裝可以最大程度抑制微生物的生長；清蒸大黃魚貯藏后關鍵揮發性成分為己醛、辛醛、壬醛、癸醛、庚醇、2-十一酮，其中氣調包裝的清蒸大黃魚風味優于普通包裝和真空包裝；清蒸大黃魚貯藏后的菌群多樣性下降，其中革蘭氏陰性菌占據優勢，優勢菌門為變形菌門、藍細菌門和擬桿菌門；在屬水平上，普通包裝組優勢菌屬為嗜冷桿菌和不動桿菌，氣調包裝組為不動桿菌與無色桿菌，真空包裝組為不動桿菌、希瓦氏菌和假單胞菌。本研究可為大黃魚加工貯藏中包裝方式的選擇提供參考。
大黃魚（Larimichthys crocea）俗名黃花魚、黃金龍等，與帶魚、小黃魚、烏賊并列為我國傳統四大海產。大黃魚作為我國沿海特有的經濟魚類，海水養殖產量居全國第一，2022年全國養殖總產量達25.7萬t，其中福建總產量達21.5萬t。隨著人們生活水平不斷提高，生活節奏加快，方便、營養的水產食品越來越受到青睞，市場潛力巨大。清蒸大黃魚可作為即食水產品進行產業化生產，其大致經過原料挑選、預處理、腌制調味、蒸制及冷卻的工藝流程。然而，大黃魚在清蒸后若未及時食用或妥善貯藏，極易因微生物活動和生理生化反應導致品質下降甚至腐敗。因此，探索有效的貯藏方法以保持清蒸大黃魚的品質和安全性至關重要。
包裝方式是影響魚類貯藏品質的關鍵因素，不同的包裝技術如真空包裝、氣調包裝等已被廣泛應用于水產品保鮮。這些技術通過調整包裝內的氣體成分，控制氧氣、二氧化碳和其他氣體的比例，旨在減緩微生物生長速率，延緩腐敗過程，延長保質期。目前市面上常見的包裝方式有普通包裝、真空包裝和氣調包裝等，因作用機制不同，用于不同包裝對象所展現出的效果有所差異。近年來，國內外有不少學者研究比較了不同包裝方式對畜肉、禽肉、生鮮水產等肉類貯藏過程中品質的影響。另外，已有研究表明氣調包裝對大黃魚鮮品貯藏品質有積極影響，但不同包裝方式對清蒸大黃魚品質及菌群的影響仍不清楚。
因此，本研究通過測定清蒸大黃魚的汁液流失率、pH值、總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、揮發性成分、菌落總數及菌群的變化情況，探究不同包裝方式下清蒸大黃魚貯藏過程中的理化性質與菌群變化規律，為清蒸大黃魚運輸及銷售過程中的貯藏條件、包裝方式的科學選擇提供參考依據。
1材料與方法
1.1材料與試劑
冰鮮大黃魚購于永輝超市。
聚乙烯（polyethylene，PE）自封袋（食品級）佛山市凡人包裝有限公司；真空袋福州旺客包裝材料有限公司；2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）（純度98%）上海麥克林生化科技有限公司；氧化鎂（純度98%）、三氯乙酸（純度98%）、乙二胺四乙酸（純度≥99.5%）、氯化鈉（純度≥99.5%）國藥集團化學試劑有限公司；KG203-03快速DNA提取檢測試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒美國Axygen公司。
1.2儀器與設備
電子分析天平；BS224S型手持pH計；T18型高速離散均質機；DQ320L-V型氣調保鮮包裝機；Kjeltec 8420型凱氏定氮儀；GR85DA型立式滅菌鍋；GSP-9160MBE型隔水培養箱、SPX-250B-Z型生化培養箱；AWCJ-1B型標準凈化工作臺；TU-1810型紫外-可見分光光度計；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統；TQ8050型氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀；HP-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；μCount3D微生物立體計數儀 丹麥BioSense公司。
1.3方法
1.3.1樣品制備
將冰鮮大黃魚去頭尾、去內臟，洗凈瀝干，魚肉在100℃沸水清蒸4 min，靜置冷卻后，分別進行普通包裝（PE自封袋）、真空包裝和氣調包裝（N2、CO2體積比6∶4），放入4℃冰箱中進行貯藏實驗，0～24 d貯藏期間，每隔6 d將3種包裝方式下的樣品各隨機取出3個，恢復至室溫后，測定樣品各項指標，以未經貯藏的清蒸大黃魚作為對照組。
1.3.2汁液流失率測定
貯藏之初，稱量包裝袋的質量。貯藏期檢測時，擦干恢復至室溫的包裝袋上的水漬后，稱取包裝袋、汁液和魚肉的總質量，小心撕開包裝袋，取出魚肉，再稱量包裝袋和汁液的總質量，貯藏過程中的汁液流失率按式（1）計算：
式中：m0為包裝袋質量/g；m1為包裝袋、汁液和魚肉的總質量/g；m2為包裝袋與汁液的總質量/g。
1.3.3 TVB-N含量測定
參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》中的自動凱氏定氮儀法測定魚肉的TVB-N含量。
1.3.4 pH值測定
稱取10 g魚肉放入燒杯中，加入50 mL蒸餾水，用均質機以5 000 r/min均質2 min后，在室溫下靜置30 min，離心后取上清液，測定pH值。
1.3.5 TBARS值測定
將魚肉研碎后，稱取10 g樣品放入錐形瓶中，再加入50 mL含0.1 g/100 mL乙二胺四乙酸的7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液，置于加熱至70℃的振蕩器中振蕩30 min，取出靜置冷卻后過濾，取上清液5 mL加入0.02 mol/L TBA溶液，在90℃的水浴鍋中加熱45 min，取出靜置冷卻至室溫后，加入5 mL氯仿，充分混勻，靜置至溶液分層。分別在532 nm和600 nm波長處測定上清液吸光度。TBARS值按式（2）計算：
1.3.6揮發性成分測定
取2.0 g樣品移入20 mL頂空瓶中，快速密封。將固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）纖維頭在GC-MS進樣口老化（250℃）至無雜峰。將樣品瓶置于SPME裝置，60℃水浴加熱10 min；將SPME纖維頭插入樣品的頂空部分，推出纖維頭，60℃水浴萃取30 min；抽回纖維頭，從樣品瓶中拔出，插入GC-MS儀進樣口，進行GC-MS分析。
G C條件：H P-5 M S柱（3 0 m×0.2 5 m m，0.25μm），載氣：氦氣，流量1.30 mL/min；進樣口溫度250℃；升溫程序：50℃保持2 min，以4℃/min升至160℃，以20℃/min升至280℃，保持2 min。MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z 35～550，GC-MS接口溫度280℃，離子源溫度200℃。
定性與定量分析：與NIST 2008和Wiley質譜庫中標準物質圖譜比對，對揮發性成分進行定性，僅正反匹配度均大于800的物質才予以保留；根據色譜圖保留峰面積計算各個揮發性成分的相對含量。
關鍵揮發性成分分析：采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）評價揮發性成分對樣品總體風味的貢獻。確定對樣品總體風味貢獻最大組分的ROAVstan＝100，其他揮發性成分的ROAV按式（3）計算：
式中：Cstan為對整體風味貢獻最大成分的相對含量/%；Tstan為對整體風味貢獻最大成分的感覺閾值/（μg/kg）；Ci為待測成分相對含量/%；Ti為待測成分的感覺閾值/（μg/kg）。
ROAV≥1，說明該成分對樣品總體風味起關鍵性作用，ROAV值越大，對整體風味貢獻越大；0.1≤ROAV＜1，說明該成分對樣品總體風味起重要修飾作用。
1.3.7菌落總數計算
參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》方法計算菌落總數。
1.3.8菌群的高通量測序
選擇清蒸大黃魚不同部位進行取樣，混勻，采用十六烷基三甲基溴化銨法提取魚肉樣品DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA的完整性。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。其中，PCR擴增體系選用ProTaq、20μL反應體系：2×ProTaq聚合酶10μL，前引物（5μmol/L）和后引物（5μmol/L）各0.8μL，10 ng/μL模板DNA 1μL，添加ddH2O至20μL。PCR擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，每個樣品各循環29次；最后在72℃下終延伸10 min。擴增結束后取3μL擴增產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保擴增產物目的條帶大小正確、濃度合適。
使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴增產物，Tris-HCl緩沖液洗脫；再次用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR擴增產物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統進行定量檢測，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例混合與Illumina測序。根據物種分類數據庫https://www.arb-silva.de/，采用USEARCH11-uparse算法按相似度97%進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，分類置信度0.7。
1.4數據處理
每組實驗重復3次，通過Excel 2019對數據進行錄入，使用IBM SPSS Statistics 26對數據進行顯著性分析，組間差異顯著性水平設定為P＜0.05，采用Origin 2021制圖。