牦牛源短小芽孢桿菌生長曲線測定及藥敏試驗、體外抑菌結果解讀（二）
1.4細菌16S rRNA PCR擴增、測序以及同源性和系統進化樹分析
將分離純化后的菌液用16S rRNA引物按照說明書進行PCR擴增，產物在10 g·L-1的瓊脂糖凝膠中進行電泳。將含有目的條帶的PCR產物原液送至北京擎科生物科技有限公司進行一代測序;將純化后的菌液送至上海凌恩生物科技有限公司進行基因組DNA提取以及全基因組測序。使用PacBio RS和Illumina測序平臺對TS1基因組進行全基因組測序。使用ABySS進行基因組組裝，再使用canu來組裝PacBio校正后的長讀數，最后用GapCloser填補剩余的局部內部空白，并糾正單堿基多態性，得到最終的組裝結果。用Circos v0.64繪制完整基因組圈圖。將測序得到的一代測序即16S rRNA序列提交到NCBI中進行BLAST比對，將同源性高于99%的菌株以及其他芽胞桿菌屬的代表菌株用Mega 5.0軟件建立系統進化樹;將全基因組測序的47個序列片段提交到BAGEL4(http://bagel.molgenrug.nl/)與數據庫進行比對，預測TS1含有的抗菌基因。將預測含有抗菌基因的序列片段用SnapGene 4.3.6軟件分析并繪圖。
1.5菌株的形態以及生化鑒定試驗
將TS1菌株按照革蘭氏染色試劑盒的說明書進行染色鏡檢觀察其形態;將純化的TS1菌液按生化鑒定管說明書接種于不同細菌生化鑒定管中，于37℃恒溫培養箱培養24 h，觀察結果并參照細菌生化鑒定編碼冊進行鑒別。
1.6菌株的生長曲線測定及耐酸、耐膽鹽試驗
將純化的TS1菌株按10 mL·L-1的接種量接種到新鮮的LB培養基中，取200μL菌液加入96孔板中，設置3個重復，置于37℃的酶標儀中，每隔1 h測量D600值，繪制生長曲線。
取50μL純化后的TS1菌液分別加入4 950μL pH值為3.02、4.06、5.03、6.04的LB液體培養基中，再取50μL純化后的菌液加入4 950μL正常LB液體培養基中作為對照，同時放入37℃、160～180 r·min-1恒溫振蕩培養箱培養16～18 h，用酶標儀分別測量酸性培養液和對照培養液培養的菌液D600值，計算菌株存活率。
另取50μL純化后的TS1菌液分別加入4 950μL牛膽鹽濃度為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%的LB液體培養液中，再取50μL活化后的菌液加入4 950μL LB液體培養基中作為對照，同時放入37℃、160～180 r·min-1恒溫振蕩培養箱振蕩培養16～18 h，用酶標儀分別測量含膽鹽的培養液和對照培養液培養的菌液D600值，計算菌株存活率。
1.7不同抗菌藥物對TS1菌株的抑菌活性
用無菌生理鹽水將TS1純化菌液稀釋至0.5麥氏濃度(約1×108 CFU·mL-1)，將稀釋后的TS1菌液均勻鋪于LB固體培養基中，選取六大類15種抗菌藥物，用K-B藥敏紙片法間隔一定距離貼藥敏紙片(具體型號見表1)，于37℃恒溫培養18 h后測量抑菌圈平均直徑(mm)，參照CLSI M100ED30的結果判讀標準描述TS1耐藥結果。
表1藥敏紙片信息
1.8 TS1菌株的體外抑菌試驗
以大腸桿菌(ATCC25922)、沙門氏菌(ATCC58785)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、豬鏈球菌(WH1609)作為指示菌，采用瓊脂擴散打孔法測定抑菌圈，每組設置3個重復。將100μL指示菌均勻鋪于LB固體培養基中，打孔后在孔中加入50～80μL的純化TS1菌液，37℃恒溫培養24 h，測量抑菌圈直徑，以抑菌圈平均直徑(mm)描述抑菌效果。
選取革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的代表菌株金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和大腸桿菌(ATCC25922)作為指示菌進行后續試驗。將純化后的菌液放入高速冷凍離心機中5 000 r·min-1離心5 min獲得菌體和上清液，用無菌PBS清洗菌體1～2次保證菌體的純度。然后采用打孔法設置試驗分組:陰性對照組、TS1全菌液組、上清液組以及菌體組，37℃培養24 h，進行TS1菌體和上清的抑菌試驗，以有無抑菌圈判定其抑菌效果。
2結果與分析
2.1短小芽胞桿菌TS1 16S rRNA PCR擴增與系統進化樹分析
從49株益生菌中分離、篩選得到1株各方面性能相對比較好的菌株，將其命名為TS1，并保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為NO.2022538。TS1 16S rRNA PCR擴增結果(圖1-A)顯示:在1 000～2 000 bp處出現明顯條帶，且陰性對照組沒有出現條帶。系統發育樹結果見圖1-B，BLAST分析發現與TS1 16S rRNA同源性高于99%的菌株均屬于短小芽胞桿菌，且與Bacillus pumilus EE112-P4聚在一支。
圖1 TS1 16S rRNA PCR擴增結果與系統進化樹分析
2.2 TS1菌株的形態以及生化鑒定結果
TS1革蘭氏染色為陽性，細菌形態為單個、短直、桿狀(圖2-A);TS1在LB培養基上生長狀況良好，菌落形態大多為直徑2～3 mm中間稍有凹陷的圓形或者橢圓形(圖2-B);將TS1分別接種不同的生化反應鑒定管，按說明書進行培養，根據生化鑒定結果(表2)并對照細菌生化鑒定編碼冊確定該菌株為短小芽胞桿菌。
圖2 TS1革蘭氏染色結果及菌株形態
表2 TS1的生化鑒定結果
圖3 TS1的生長曲線及耐酸、耐膽鹽結果
2.3 TS1的生長曲線測定及耐酸耐膽鹽試驗
用丹麥Biosense微生物生長動態監測系統每隔2 h測定TS1 48 h的生長曲線(圖3-A)，結果顯示，TS1在培養約4 h進入對數生長期，繁殖快速，菌體濃度增加，在22 h左右到達平臺期且48 h仍然保持穩定，說明穩定期的維持時間長;由圖3-B和C可知，TS1在低pH值和高膽鹽含量下存活率仍然較高，說明TS1能在畜禽的胃以及腸道中存活。
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