量化人類腸道菌種對艱難梭菌長期生長的影響（三）
通過對其他8種人類腸道細菌在高碳水化合物培養基中的單菌培養進行代謝組學分析，我們發現，在這種環境中，艱難梭菌與腸道細菌之間的潛在交叉喂養總體上較為稀少。具體來說，其他腸道物種釋放的代謝物中，只有約3%–15%被艱難梭菌單菌培養利用(圖S6G)。在9種腸道細菌中，CS和CH與艱難梭菌的代謝物利用重疊率最高(分別為61%和36%，圖S6E和S6G)，可能在司提克蘭氏反應的氨基酸上與艱難梭菌競爭。這種潛在的資源競爭與它們在與艱難梭菌共培養中的滅絕情況一致(圖S1C和S1F)，因為CS和CH的生長速率也低于艱難梭菌(圖S6H–S6J)。
除了交叉喂養，這種共存還可能通過利用非重疊資源來實現。在高碳水化合物培養基中，艱難梭菌消耗的代謝物中有21%是獨特的(圖S6B)，這表明正交生態位可能使艱難梭菌與某些腸道物種共存。在這些細菌中，艱難梭菌消耗的代謝物種類數量僅次于CS(圖S6D)，表明艱難梭菌具有靈活而廣泛的代謝生態位。
發酵終產物在腸道微生物組的種間相互作用中起重要作用。因此，除了通過液相色譜-質譜聯用(LC-MS)測量的廣泛代謝物組外，我們還量化了艱難梭菌和PV在生長24小時后培養上清液中丁酸、乳酸、乙酸和琥珀酸的濃度(圖2C和2D)。這些發酵終產物在腸道中可達到高濃度，并影響人類健康。例如，丁酸是一種有益代謝物，是結腸細胞的主要能量來源，促進腸道穩態，并已被證明可減少小鼠艱難梭菌感染(CDI)的疾病嚴重程度。盡管艱難梭菌和PV都產生乙酸，但PV產生琥珀酸，艱難梭菌則產生丁酸。在共培養中，琥珀酸濃度顯著低于PV單菌培養，而丁酸濃度顯著高于艱難梭菌單菌培養(圖2C)。這表明艱難梭菌將PV釋放的琥珀酸轉化為丁酸。從擬桿菌到艱難梭菌的琥珀酸交叉喂養在小鼠中也被觀察到，這表明這種代謝交換在哺乳動物腸道中具有重要意義。此外，艱難梭菌產生乳酸并被PV利用，表明代謝物的雙向交換(圖2C和2D)。總之，這些數據表明，PV和艱難梭菌能夠通過多種代謝物的交換進行相互作用。
除了高碳水化合物濃度環境中資源競爭的增強和代謝物交叉喂養的減少外，PV在單菌培養及與艱難梭菌的共培養中顯著降低了培養基的pH值(圖S7A)。由于研究表明艱難梭菌的生長在低pH條件下會受到負面影響，15 PV引起的培養基酸化可能促進了競爭性排除的動態。在有限碳水化合物培養基中，未觀察到培養基酸化，這與艱難梭菌和PV在該環境中的共存相一致(圖2A)。
總體而言，碳水化合物有限的環境促進了代謝物交叉喂養以及艱難梭菌和PV之間的共存(圖2E)。在高碳水化合物濃度的環境中，資源競爭可能占主導地位，并導致培養基pH顯著降低。因此，在與PV的共培養中，艱難梭菌的生長受到抑制，最終在約第35–42次傳代后被排除(圖2F)。
在與PV長期共培養后艱難梭菌種群中的關鍵代謝基因出現單點突變
除了生態交互外，艱難梭菌與PV的長期共存可能會導致艱難梭菌的進化適應，這對人體腸道可能具有重要意義。為識別在有限碳水化合物培養基中長期共培養后CD-PV群體中出現的突變，我們對第35、49和64次傳代(即第186、261和341代)的CD-PV群體進行了全基因組測序(whole-genome sequencing,WGS)。結果在艱難梭菌群體中檢測到多個非同義單點突變，突變頻率約為14%至97%(圖S8A；表S5)。由于突變和遺傳漂變的隨機性，重復實驗的群體未顯示完全相同的進化動態。
檢測到的非同義突變基因的預測功能與毒力、膜蛋白、ATP結合盒(ABC)轉運蛋白和代謝(如磷酸轉移酶系統(phosphotransferase system,PTS)和Stickland代謝調控因子)相關。這些基因中的一些在來自健康個體和感染艱難梭菌疾病(CDI)患者的18株分離株中表現出氨基酸變異(圖S8B)，表明這些序列變異可能對進化適應有貢獻。此外，我們還檢測到PV基因組中從第35次到第64次傳代出現的多處突變，突變頻率約為18%至46%(表S5)。
在艱難梭菌群體中的所有突變中，基因206(G533W)和prdR(A341V)在所有測量的傳代中頻率都顯著增加，并在64次傳代后顯示出最高頻率(圖S8A；表S5)。基因206編碼一種PTS糖運輸子單元IIA，這一基因突變出現在CD-PV共培養的所有三次重復實驗中，并在所有突變中顯示出最高頻率(傳代35約56%，傳代49可達97%)。相比之下，prdR突變只出現在第49次傳代的CD-PV共培養實驗的一次重復中(約15%)，并在第64次傳代達到約47%。這一現象與基因206在18株自然分離株中氨基酸序列顯示出變異相關，而prdR的序列高度保守(圖S8B)。因此，prdR的突變可能僅在特定條件下(如基因206突變背景下)發生。prdR是一個核心代謝調節因子，控制丙氨酸和甘氨酸的優先利用，通過Stickland反應產生能量，這對于艱難梭菌的生長和定植至關重要。在丙氨酸存在的情況下，prdR激活編碼丙氨酸還原酶的基因的轉錄，并負調節編碼甘氨酸還原酶的基因。以前的研究表明，prdR的缺失會影響艱難梭菌毒素的產生。
為了進一步表征這些單點突變，我們從CD-PV群體最后一次傳代中分離出一株攜帶基因206和prdR兩處突變的艱難梭菌菌株(圖3A)。WGS驗證了這兩處突變僅出現在所分離的艱難梭菌菌株(演化菌株)中，而未出現在祖先株中的甘油庫存菌株(表S6和S7)。在有限碳水化合物培養基中與PV共培養341代后，演化艱難梭菌菌株趨于接近于等比例，而祖先株的豐度則遠離等比例(基于Mann-Kendall檢驗的顯著趨勢，圖S7B和S7C)。因此，艱難梭菌菌株與PV共存的穩定性高于祖先株。
圖3|艱難梭菌獲得了長期與PV共培養過程中，改變其代謝生態位的進化
(A)艱難梭菌在與PV共培養的限碳環境中，經過341代分離出來。社區動態的圖表來自于圖S4F。
(B)祖代和進化代艱難梭菌株的代謝利用量對數變換的折疊變化熱圖，與空白培養基相比(n=3)。與空白培養基相比顯著高濃度的代謝物顯示在圖中(兩側t檢驗，方差不齊)。星號表示在代謝物釋放量之間有顯著差異(兩側t檢驗，p值<0.05)。
(C)全基因組轉錄組剖析實驗的示意圖。
(D)進化代艱難梭菌株與祖代株轉錄折疊變化的火山圖。每個數據點代表一個單獨的基因。虛線表示2倍變化，水平虛線表示由DESeq2的Wald檢驗計算的統計顯著性閾值(貝南明-霍奇伯格多重檢驗校正，BH調整p值=0.05)。
(E)選定基因在進化代艱難梭菌株中高表達和低表達的對數變換折疊變化。垂直虛線表示2倍變化。
(F)當在不同脯氨酸濃度下與PV共培養時，艱難梭菌的豐度。條形圖顯示了12小時時艱難梭菌的豐度(均值±SD，n=3)。兩側未配對t檢驗p值顯示在圖中。
(G)進化代艱難梭菌株與祖代株在不同葡萄糖和脯氨酸濃度下的適應性熱圖。適應性比較通過單培養生長下的曲線下面積(AUC)比率量化(圖S11)。星號表示未配對t檢驗之間的顯著性p值。?p<0.05，??p<0.01，???p<0.001。×符號表示未生長。具體p值見圖S11。
(H)進化代艱難梭菌株代謝改變的示意圖。
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