lmo1508/lmo1509基因缺失對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線、抗氧化應(yīng)激能力的影響（二）
1.4 gsh-px報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
1.4.1 目的片段的擴(kuò)增
以10403S基因組為模板，利用表2中的pFL516 A/B引物對(duì)擴(kuò)增gsh-px的啟動(dòng)子片段Pgsh-px；以pFL251為模板，利用pFL516 C/D引物對(duì)擴(kuò)增gfp片段，PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。以上述PCR擴(kuò)增獲得的Pgsh-px啟動(dòng)子和gfp為模板，用pFL516 A/D引物對(duì)進(jìn)行SOE-PCR獲得pFL516（Pgsh-px-gfp）目的片段，使用DNA回收試劑盒將融合片段回收備用。
1.4.2 報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
采用重組的方法將Pgsh-px-gfp目的片段與SalⅠ單酶切的載體質(zhì)粒pERL3連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，長(zhǎng)出菌落后挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定。將PCR鑒定陽(yáng)性的克隆送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的gsh-px報(bào)告基因重組質(zhì)粒命名為pFL516。
1.5 熒光蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建
提取構(gòu)建成功的pFL516質(zhì)粒，利用電轉(zhuǎn)化法將pFL516質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入LM菌株10403S感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)程序?yàn)椋?.5 kV、400 Ω、25 μF，電擊完成后加入1 mL含0.5 mol/L蔗糖的BHI培養(yǎng)基，置于37 ℃靜置培養(yǎng)3 h后涂布于含10 μg/mL紅霉素的BHI平板，37 ℃培養(yǎng)24~48 h，挑取單菌落使用pFL516 A/D引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.6 熒光蛋白表達(dá)觀察
取10 μL過(guò)夜培養(yǎng)的10403S-pFL516涂布到載玻片上，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)菌GFP表達(dá)情況，同時(shí)使用未轉(zhuǎn)入pFL516的野生株10403S作為對(duì)照。另取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液后用1 mL PBS將細(xì)菌沉淀重懸，重懸完全后加入到96孔板中，每孔200 μL，3個(gè)重復(fù)，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液的相對(duì)熒光單位（RFU，即熒光值）。數(shù)據(jù)結(jié)果為3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值。
1.7 gsh-px基因調(diào)控因子的篩選
將gsh-px的報(bào)告質(zhì)粒pFL516電轉(zhuǎn)進(jìn)TCS缺失株中，涂布于含紅霉素抗性的BHI平板上，置于37 ℃培養(yǎng)24~48 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，獲得攜帶pFL516報(bào)告基因的菌株。通過(guò)檢測(cè)綠色熒光的強(qiáng)度對(duì)gsh-px基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，熒光值越高說(shuō)明轉(zhuǎn)錄水平越高，反之則說(shuō)明轉(zhuǎn)錄水平越低，以親本株10403S-pFL516為對(duì)照組。
將攜帶gsh-px報(bào)告質(zhì)粒的TCS缺失株劃線于含紅霉素抗性的BHI平板上，次日挑取單菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。每個(gè)菌株各取1 mL菌液于離心管中，12 000 r/min離心2 min后棄去上清液，非應(yīng)激樣品用1 mL PBS將細(xì)菌沉淀充分重懸，應(yīng)激樣品用5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+應(yīng)激處理1 h后用1 mL PBS將細(xì)菌沉淀充分重懸，每孔200 μL，3個(gè)重復(fù)，測(cè)量細(xì)菌菌液的熒光值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。
1.8 生長(zhǎng)曲線測(cè)定
分別從親本株10403S、缺失株Δlmo1508/lmo1509的固體平板上挑取單菌落接種于液體BHI中，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以1∶100比例接菌至新的BHI培養(yǎng)基中，并分裝到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600 nm值，每隔1 h測(cè)定1次，直至進(jìn)入平臺(tái)期，并據(jù)此繪制出生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。
1.9 氧化應(yīng)激試驗(yàn)
為了確定報(bào)告基因篩選出的TCS的調(diào)控作用，將pFL516報(bào)告基因熒光值顯著升高的TCS缺失株進(jìn)行金屬離子氧化應(yīng)激存活試驗(yàn)，參考張鈺等方法進(jìn)行。12 000 r/min離心2 min收集過(guò)夜培養(yǎng)的菌體，并用PBS洗滌一次，然后稀釋至OD600 nm值為0.6。將稀釋好的菌液分別加入終濃度為5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃靜置處理1 h。應(yīng)激處理后10倍倍比稀釋菌液，稀釋菌液進(jìn)行點(diǎn)板后過(guò)夜培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)菌株存活率。試驗(yàn)重復(fù)3次。若pFL516熒光值及5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+金屬離子氧化應(yīng)激存活試驗(yàn)結(jié)果均有顯著差異且結(jié)果一致時(shí)則可初步確定該TCS為GSH-Px的調(diào)控因子。
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