微生物生長曲線監(jiān)測儀測定納米銀對副溶血弧菌的最小抑菌濃度（一）
摘要由于河口水具有復雜的物理和化學性質，準確、高效地測定納米銀在其中的抑菌效應是個國際性挑戰(zhàn)。本研究基于電子微生物生長曲線監(jiān)測儀建立了一種自動化表型方法。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)在河口水中暴露于納米銀之后，暴露混合液直接被加進預裝有Luria-Bertani液體培養(yǎng)基的檢測管中，置入電子微生物生長曲線監(jiān)測儀測定細菌的生長動力學曲線，根據(jù)細菌生長曲線判讀納米銀對副溶血弧菌的最小抑菌濃度。
采用電子微生物生長曲線監(jiān)測儀測定了納米銀在8個河口水樣品中的抑菌效應，結果表明，所得最小抑菌濃度值都與采用經典平板計數(shù)法和微量肉湯稀釋法所得結果吻合良好。較之于經典方法，所建新方法的優(yōu)勢在于無需去除暴露混合液中諸如懸浮顆粒之類的復雜共存物，因此操作更簡便、勞動強度小，總周期縮短至少20 min，并有效降低了主觀和客觀操作誤差風險，具有良好的精密度和重現(xiàn)性。
此外，電子微生物生長曲線監(jiān)測儀法測得的最小抑菌濃度值通常不低于平板計數(shù)法和微量肉湯稀釋法所得數(shù)值，表明該基于傳感器識別結果的方法比基于視覺判別結果的方法具有更高的靈敏度。本研究為準確、高效測定納米材料在諸如河口水之類復雜介質中的環(huán)境毒理效應提供了新手段。
納米銀(Ag NPs)具有獨特的抗菌性能，是世界上最常用的納米材料之一，廣泛應用于醫(yī)療設備、化妝品、紡織品、電子、玩具和家用電器等領域。Ag NPs的廣泛應用使它們不可避免地會通過廢水、大氣沉降和其他途徑進入河流、湖泊、河口和沿海水域，引發(fā)了人們對其生態(tài)安全性的擔憂。對于河口環(huán)境中納米材料的風險評估而言，微生物(尤其是細菌)是理想的指示物。因此，準確測定納米材料對細菌的抑制效應是進行環(huán)境風險評估活動的必要前提之一。Kirby-Bauer紙片擴散法、顯微鏡法、平板計數(shù)法、生物量測定法、微量肉湯稀釋法(BMD)、電化學傳感器、表面增強拉曼光譜法和濁度法(OD)等基于微生物生長分析的表型方法已經被廣泛應用于測定納米材料對細菌的抑制效應。
基于遺傳物質分析的基因型方法(如PCR、qPCR、RT-PCR和高通量測序)由于可以節(jié)約細菌培養(yǎng)所需時間，近年來也發(fā)展迅速。這些表型和基因型方法在測定實驗室單純介質(如培養(yǎng)基)中納米材料對微生物的影響時具有很好的性能。然而，當它們被用于測定納米材料在真實的復雜介質(如河口水樣)中對微生物的影響時，必需經過繁瑣的分離、純化等前處理步驟，不僅效率低，而且主客觀誤差也在所難免。
目前，準確、高效地測定實際復雜樣品介質中納米材料抑菌效應的分析方法依然是業(yè)界的急迫需求。近年來，我們團隊研制出了一種基于電容耦合非接觸電導(C 4)原理的多通道傳感器，為在線監(jiān)測微生物生長過程提供了可能。C 4檢測是一種獨特的電導率分析方法，工作時電極不與被測試介質直接接觸，輸出的信號值正比于介質導電離子濃度及介質中載流子的遷移率。它不僅具有經典接觸式電化學分析技術的優(yōu)點——如儀器簡單、成本低廉、響應速度快、不受濁度影響、易于小型化等，而且不存在電極的極化、鈍化和污染風險。我們基于該多通道傳感器，研制出了32通道電子微生物生長曲線監(jiān)測儀。但是，尚未曾采用EMGA建立測定河口水中納米材料抑菌效應的方法。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)廣泛存在于河口及近岸環(huán)境中，是一種條件性致病的革蘭氏陰性嗜鹽菌。
另一方面，它們還具有優(yōu)異的異養(yǎng)硝化–好氧反硝化能力，能夠降解碳氫化合物、木質素等一些難降解的化合物。因此，探索Ag NPs對河口水中副溶血弧菌的影響具有重要的科學意義。
本研究以副溶血弧菌為模式微生物，通過采用EMGA測定Ag NPs脅迫下細菌生長動力學曲線，建立一種分析納米材料在河口水中抑菌效應的高效方法，探討該方法的可靠性和實用性，并采用經典的BMD法和平板計數(shù)法進行性能驗證。
1材料與方法
1.1細菌培養(yǎng)與計數(shù)
副溶血弧菌標準菌株(ACTT17802)購自北京百歐博偉生物技術有限公司，采用Zhang等報道的方法進行培養(yǎng)。Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基干粉購自青島海博生物技術有限公司，采用超純水制成實驗用液體培養(yǎng)基(含0.5 g/L NaCl、10.0 g/L胰蛋白胨和5.0 g/L酵母提取物)。副溶血弧菌在LB液體培養(yǎng)基中接種，在Herocell C1S型培養(yǎng)箱(上海潤度生物科技有限公司,上海)中于36℃下150 r/min輕搖預培養(yǎng)過夜。然后選擇活性菌株，轉移到新的液體培養(yǎng)基中。第2次培養(yǎng)達到指數(shù)期后(約14 h)，取出一部分用標準平板計數(shù)法測定細菌濃度(單位CFU/mL)。其余培養(yǎng)液以三平行進行梯度稀釋備用。除特殊說明之外，本研究中使用的所有化學試劑均為分析純。
1.2Ag NPs的制備與表征
采用Bastús等報道的濕化學法制備Ag NPs。50 mL檸檬酸鈉(5 mmol/L)和單寧酸(0.25 mmol/L)的水溶液在三頸圓底燒瓶中油浴，劇烈攪拌下回流15 min。然后在溶液中注入0.5 mL 25 mmol/L的AgNO 3。關閉加熱器，讓反應持續(xù)10 min。冷卻后，取出生成物。通過3次離心除去未反應物以純化產物，最終獲得0.80 g/L的Ag NPs純水分散液。產物采用透射電鏡、紫外-可見分光光度計(Lambda 900,PerkinElmer,美國)和粒度儀(Malvern,英國)進行形貌與性質表征。