速生集胞藻6803光合放氧速率、生長曲線及基因組分析（一）
【背景】藍藻是一類能進行放氧光合作用的原核生物。隨著生長速率與異養微生物相仿的速生藍藻的出現，藍藻在光合細胞工廠領域備受關注。集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803是研究光合作用的理想模式生物，也是近年來常用的光合固碳產化學品底盤細胞，其基因組測序最早被公開，并且比常用模式藍藻聚球藻具有更強的環境適應性及性狀穩定性，但目前尚未見速生集胞藻的報道。
【目的】評價本實驗室選育的在高光強下可以快速生長的集胞藻6803(高光6803)在高光強下的光合生理，并初步研究其分子機制。
【方法】通過比較分析光合生理，評價高光6803性狀穩定性；通過基因組學及轉錄組學比較分析，初步解析高光6803的分子機制。
【結果】獲得1株快速生長的集胞藻，即高光6803，其生長速率和光合活性均遠高于普通集胞藻6803，并且性狀穩定；其最短倍增時間約3.1 h，與已報道的速生聚球藻(Synechococcus elongatus)UTEX 2973相當；其在900μmol/(m2·s)的高光強下仍可快速生長，并且最適光強是野生型集胞藻6803的3倍以上?；蚪M學比較分析發現高光6803基因組中有2個特有基因突變。轉錄組學比較分析發現，在高光條件下，高光6803中差異表達的基因有77個，其中上調基因36個，下調基因41個。表達上調的基因主要參與光系統II(photosystem II,PSII)反應中心、高光脅迫耐受、電子傳遞、有機物合成，而表達下調的基因主要參與糖類、氨基酸等有機物分解過程。
【結論】本研究首次報道了速生集胞藻高光6803，并對其分子機制進行初步研究。找到與其高效利用高光快速生長相關的2個突變靶基因，并從轉錄組水平說明高光6803是通過高效利用光能而快速生長。因此，本研究不僅拓寬了速生藍藻的種類，為研究光合微生物固碳產化學品提供了高效的底盤細胞，也為將其他藍藻改造為速生藍藻提供了基因靶點及理論基礎。
藍藻是地球上已知最早可進行放氧光合作用的原核自養生物，除了參與光合作用的結構、組分與高等植物類似，其光能轉化效率顯著高于后者；此外，藍藻還具有結構簡單、代時短及易于基因操作的優點，使其一直是研究光合作用的理想模式生物。近20年來，由于溫室氣體CO2排放日益加劇，迫切需要實現對CO2資源化利用，這使得藍藻成為利用CO2生物合成化學品的理想底盤細胞，其中最常用的有集胞藻(Synechocystis sp.)6803、聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002、速生聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942和速生聚球藻UTEX 2973。到目前為止，在各國科學家共同努力下，通過對藍藻進行代謝工程改造，已有近30種化學品可在藍藻中實現由CO2直接合成，如乙醇、丁醇等燃料；丙酮、異丙醇、乳酸、乙醇酸等大宗化學品；異戊二烯、檸檬烯、法尼烯等萜烯類化合物和其他高附加值化學品。但相較于異養微生物，光合自養微生物藍藻生長慢，使光合自養藍藻利用CO2產化學品的產率與異養微生物利用葡萄糖產化學品間有百倍的差距，藍藻光合固碳產化學品的產業化發展因此嚴重受限。
近年來，隨著生長速率與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接近的速生藍藻相繼被發現，藍藻光合固碳產化學品領域迎來了希望。2015年，研究人員首次報道了速生藍藻，即從聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 6301中分離到的速生聚球藻UTEX 2973，其生長速率約是聚球藻6301和聚球藻7942生長速率的2倍以上，但3株藻在基因組層面上的序列相似性超過99.0%，當培養條件優化為500μmol/(m2·s)、41℃、3.0%CO2時，速生聚球藻UTEX 2973的倍增時間可縮短至2.1 h，接近釀酒酵母的生長速率。隨后又有幾株耐高光的速生藍藻相繼被分離到，其中聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 11801、聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 11802及聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 11901在光強750μmol/(m2·s)和1 000μmol/(m2·s)培養條件下仍可生長；目前發現的4株速生藍藻均為聚球藻，雖然基因組測序顯示，這4株速生藍藻和聚球藻7942的序列相似性超過80.0%，其中速生聚球藻UTEX 2973與聚球藻7942的相似性甚至超過99.8%，但在高光利用和生長速率方面，這4株速生藍藻都明顯優于聚球藻7942。
在所有模式藍藻中集胞藻6803的基因組序列最早被公布，因此研究者們對該藻開展了大量研究工作。清晰的遺傳背景、易于基因操作、性狀穩定等優勢，也使其成為利用CO2生產化學品的理想底盤細胞。目前已有光合固碳產化學品做到規模化測試階段的報道，如集胞藻6803以CO2為原料產乙醇項目，產量已達到1 000 L/d。因此，集胞藻6803是極具工業化應用潛力的藍藻藻株。但目前發現的速生藍藻均屬于聚球藻屬，尚無速生集胞藻的報道。
為得到速生集胞藻，我們根據國內外現有4株速生聚球藻都具有高光強下快速生長這一特質，利用高光強條件對實驗室常用的集胞藻6803進行高光馴化培養。幸運的是，經約1年的培養馴化，我們得到1株可在900μmol/(m2·s)高光培養條件下快速生長的集胞藻6803，其生長速率明顯快于野生型6803，我們將其命名為高光6803。本研究以期為探究高光6803的耐高光機制及其耐高光、快速生長性狀的穩定性奠定了基礎，這不僅能夠拓展速生藍藻的種屬范圍，還能為藍藻光合固碳產化學品的研究提供優質、高效的底盤細胞，所得的新認識可為將其他種屬藍藻改造為速生藍藻的研究提供參考。
2結果與分析
2.1高光對高光6803生長的影響
為研究高光6803耐高光速生表型的穩定性，我們首先比較了高光6803和野生型6803在高光下的生長狀況。
如圖1A所示，在900μmol/(m2·s)高光條件下培養1 d后，相較于野生型6803(0.71±0.02)，高光6803菌液不僅顏色更深、更綠，而且OD730數值也高2.3倍(2.36±0.05)。如圖1B所示，在接下來的培養過程中，2株集胞藻的OD730、生長速率差異繼續擴大，在第3天，高光6803的OD730(6.98±0.26)是野生型6803(0.78±0.03)的8.9倍；在第6.5天，高光6803的生長速率增長已趨緩，但仍明顯高于野生型6803。
在900μmol/(m2·s)高光條件下，野生型6803表現出生長受限；高光6803仍保持著快速生長的狀態，未受到高光抑制。經計算后可知，本研究中高光6803的最短倍增時間是3.1 h，野生型6803的倍增時間是6.9 h，前者是后者的44.9%，是論文報道的野生型6803最短倍增時間6.6 h的47.0%。以上結果證明了高光6803可利用高光快速生長。
圖1在高光900μmol/(m2·s)下高光6803與野生型6803培養1d的菌液比較(A)與生長曲線(B)HL6803：高光6803；WT6803：野生型6803；OD730：藻液在730 nm處測得的光密度。
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