基于微生物生長曲線監測系統探究肺炎克雷伯菌菌株毒力與碳青霉烯類耐藥性的關系（二）
1材料與方法
1.1菌株來源、儀器及試劑
收集2016—2019年四川大學華西醫院血流感染患者血培養分離的192株非重復肺炎克雷伯菌，其中96株為CRKP，96株為CSKP。
微生物生長曲線監測系統為丹麥Biosense公司產品；PCR儀器為美國Bio-Rad公司產品；Illumina HiSeq X10測序平臺為美國Illumina公司產品；培養基為鄭州安圖生物工程股份限公司產品；DNA提取試劑盒為德國Qiagen公司產品。
大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和金黃色葡萄球菌ATCC25923為藥敏試驗質控菌株；肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705（blaKPC陽性）、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706（碳青霉烯酶基因陰性）和肺炎克雷伯菌ATCCBAA-2146（blaNDM陽性）為PCR質控菌株。
1.2全自動微生物分析儀檢測抗菌藥物敏感性
通過丹麥Biosense微生物生長曲線監測系統對菌株進行藥敏試驗，根據臨床實驗室標準協會指南（CLSI-M100）對最低抑菌濃度值進行判讀。
1.3 PCR檢測碳青霉烯酶基因
通過PCR檢測五種常見的碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA），對純化符合預期大小的PCR產物進行測序驗證。
1.4拉絲實驗結合PCR檢測鑒定菌株的高黏表型、毒力基因和莢膜分型
采用拉絲實驗鑒定高黏表型。使用標準接種環挑取單個菌落，拉絲在5 mm及以上視為菌株具有高黏表型。通過PCR檢測6種莢膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）和magA、allS、rmpA、mrkD、fimH、Kfu、entB、ybtS、鐵載體需氧菌素（aerobictin）和iutA等10種毒力基因。將攜帶rmpA和iutA基因同時具有高黏表型的菌株定義為HVKP。
1.5全基因組測序檢測CR-HVKP的基因組特征
采用DNA提取試劑盒提取CR-HVKP菌株的基因組DNA，通過Illumina HiSeq X10平臺進行基因組測序，使用Sickle（GitHub）和SPAdes 3.8軟件修剪并組裝基因組，再通過Institut Pasteur、ResFinder和Pasteur等數據庫分別對CR-HVKP菌株的MLST、耐藥基因和毒力基因進行比對鑒定。
1.6生物膜形成試驗檢測菌株的生物膜形成能力
通過生物膜形成試驗檢測CR-HVKP菌株的毒力。選取6株肺炎克雷伯菌（不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、標準菌株ATCC700603），以無菌LB肉湯作為空白對照測定菌株的生物膜形成。根據吸光度值將菌株生物膜形成能力分為弱（吸光度值≤0.4）、中（吸光度值>0.4~0.6）、強（吸光度值>0.6）。
1.7血清抗性實驗檢測CR-HVKP菌株對血清抗體的反應
采用血清抗性實驗驗證CR-HVKP的毒力。選取6株肺炎克雷伯菌（不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、標準菌株ATCC700603）與人正常血清混合，觀察活菌數。根據活菌數將血清抗性的反應分為六個等級：血清敏感（1或2級）、中度敏感（3或4級）和血清抵抗（5或6級）。
1.8統計學方法
采用WHONET和SPSS 22.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（ˉx±s）描述。計數數據以百分比（%）描述，組間比較采用χ2檢驗，當n<5時，使用Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism軟件繪圖。
2結果
2.1不同耐藥表型菌株對常見抗菌藥物的耐藥性比較
96株CRKP和96株CSKP對常見抗菌藥物的耐藥性見表1。CRKP對頭孢類、酶抑制劑類和碳青霉烯類藥物耐藥率均在90%以上，對氨基糖苷類耐藥率相對較低；CSKP則對頭孢類、酶抑制劑類、氨基糖苷類和碳青霉烯類藥物保持較好的敏感性。除米諾環素外，兩組菌株對常見抗菌藥物的耐藥率差異均有統計學意義（均P<0.05）。結果提示，CRKP對抗菌藥物耐藥率明顯高于CSKP。
表1碳青霉烯類敏感和耐藥肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率比較
與CSKP比較，*P<0.05，**P<0.01.CSKP：碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌.
2.2不同耐藥表型菌株碳青霉烯酶基因檢測結果
96株CRKP中，檢出碳青霉烯酶基因92株，其中77株（83.7%）僅檢出blaKPC-2，11株（12.0%）僅檢出blaNDM-5，4株（4.3%）同時檢出兩種基因（2株同時檢出blaKPC-2和blaNDM-1，2株同時檢出blaKPC-2和blaNDM-5）。96株CSKP均未檢出碳青霉烯酶基因。結果提示，CRKP菌株對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制是產碳青霉烯酶，以blaKPC-2基因為主。
2.3不同耐藥表型菌株高黏表型、毒力基因和莢膜分型檢測結果
經檢測，CRKP中4株（4.2%）具有高黏表型，而CSKP中36株（37.5%）具有高黏表型，兩者高黏表型差異具有統計學意義（P<0.01）。
96株CRKP中，檢出莢膜抗原3株（3.1%），均為攜帶K57。96株CSKP中，檢出莢膜抗原37株，其中20株（20.8%）攜帶K1，13株（13.5%）攜帶K2，2株（2.1%）攜帶K5，1株（1.0%）攜帶K20，1株（1.0%）攜帶K54。CRKP和CSKP中entB、mrkD和fimH基因檢出率均超過90.0%，兩組間差異無統計學意義。Kfu、aerobictin、iutA、ybtS、rmpA、magA、allS以及莢膜抗原K1和K2在CSKP的檢出率均高于CRKP（均P<0.01）。見表2。CRKP與CSKP攜帶的毒力基因種類亦存在差異：CRKP中87.5%攜帶3種毒力基因，6.3%攜帶4種毒力基因；而CSKP中33.3%攜帶3種毒力基因，17.7%攜帶10種毒力基因，13.5%攜帶7種毒力基因。根據1.4中HVKP的定義，CRKP中1株為HVKP（CR-HVKP），CSKP中36株為HVKP，兩者HVKP比例差異具有統計學意義（P<0.01）。結果提示CRKP毒力基因攜帶率低于CSKP。
表2碳青霉烯類敏感和耐藥肺炎克雷伯菌毒力基因或莢膜抗原檢出情況比較
—：無相關資料.CSKP：碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；entB：鐵載體腸桿菌素；mrkD：黏附因子3型菌毛基因；fimH：黏附因子1型菌毛基因；aerobictin：鐵載體需氧菌素；rmpA：黏液樣表型A調節基因；iutA：鐵載體氣桿菌素；ybtS：鐵載體耶爾森桿菌素；Kfu：克雷伯菌鐵攝取蛋白；allS：尿囊素代謝基因；magA：黏液相關基因A.相關新聞推薦
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