?新疆地區(qū)侵襲性念珠菌感染菌株耐藥性特征及分子機(jī)制研究（一）
摘要
本研究系統(tǒng)分析了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2022年6月至2023年6月臨床分離的109株侵襲性念珠菌的耐藥特征及分子機(jī)制。通過形態(tài)學(xué)鑒定與ITS測序確認(rèn)菌種分布，采用oCelloScope微生物快速藥敏監(jiān)測系統(tǒng)精確測定9類抗真菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），并針對唑類耐藥菌株進(jìn)行ERG11和PDR1基因測序分析。結(jié)果表明：白念珠菌（50.45%）仍為優(yōu)勢菌種，但非白念珠菌（光滑念珠菌18.02%、熱帶念珠菌15.32%）的耐藥率顯著升高；熱帶念珠菌對泊沙康唑的耐藥率達(dá)64.71%（11/17），光滑念珠菌對伏立康唑的耐藥率達(dá)70%（14/20）；分子機(jī)制研究證實(shí)，熱帶念珠菌唑類耐藥與ERG11基因Y132F/S154F突變相關(guān)，光滑念珠菌耐藥則主要由PDR1基因S76P/V91I/L98S/T143P突變介導(dǎo)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)K425R/F948S等新突變位點(diǎn)。本研究為深入理解念珠菌耐藥機(jī)制提供了重要科學(xué)依據(jù)。
1.引言
侵襲性念珠菌病是醫(yī)院內(nèi)常見的嚴(yán)重真菌感染，其死亡率高達(dá)50%。隨著抗真菌藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用，念珠菌的耐藥問題日益突出，尤其是多重耐藥"超級真菌"的出現(xiàn)，對全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。念珠菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，涉及靶點(diǎn)突變、外排泵激活、生物膜形成等多種因素。不同地區(qū)念珠菌的耐藥譜存在顯著差異，這與當(dāng)?shù)氐尼t(yī)療實(shí)踐、抗真菌藥物使用習(xí)慣及環(huán)境因素密切相關(guān)。
新疆地處中國西北邊陲，具有獨(dú)特的地理環(huán)境、民族構(gòu)成和醫(yī)療條件，其念珠菌耐藥特征可能與內(nèi)地存在差異。本研究聚焦新疆地區(qū)侵襲性念珠菌感染菌株的耐藥性特征，通過高精度藥敏檢測與分子機(jī)制解析，系統(tǒng)闡明該地區(qū)念珠菌耐藥的流行病學(xué)特征和分子基礎(chǔ)，為深入理解念珠菌耐藥機(jī)制提供區(qū)域化科學(xué)依據(jù)。
2.材料與方法
2.1標(biāo)本來源與處理
本研究收集2022年6月至2023年6月期間新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為侵襲性真菌病住院患者的各類標(biāo)本，包括無菌體液、分泌物、支氣管肺泡灌洗液、痰液等。標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)后分離得到念珠菌菌株共計(jì)125株，嚴(yán)格剔除以下兩類菌株：一是同一患者同一部位重復(fù)送檢的同種菌株；二是首次培養(yǎng)陽性前一周內(nèi)接受過抗真菌治療患者的分離菌株。最終納入109株臨床分離念珠菌用于后續(xù)研究。
2.2菌種鑒定
所有標(biāo)本接種于法國科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天。通過觀察菌落的形態(tài)、顏色等特征進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定；同時(shí)，采用分子生物學(xué)鑒定方法，對菌株的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)（ITS）進(jìn)行測序，以明確菌株的具體種類，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2.3抗真菌藥物敏感性檢測
采用oCelloScope微生物快速藥敏監(jiān)測系統(tǒng)（丹麥BioSense Solutions公司）進(jìn)行抗真菌藥體外敏感性檢測。該系統(tǒng)基于實(shí)時(shí)細(xì)胞成像技術(shù)，通過動(dòng)態(tài)觀察微生物生長狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)對真菌最低抑菌濃度（MIC）的快速、精準(zhǔn)測定。檢測的抗真菌藥物包括9種臨床常用藥物：唑類藥物（氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑）、棘白菌素類藥物（卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈）、多烯類藥物（兩性霉素B）以及嘧啶類抗真菌藥（5氟胞嘧啶）。
藥敏結(jié)果的判讀依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）最新文件中規(guī)定的臨床折點(diǎn)（CBPs）；對于尚無臨床折點(diǎn)的藥物，則參考流行病學(xué)界值（ECVs）進(jìn)行判讀。為保證檢測結(jié)果的質(zhì)量控制，本研究選擇近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258作為質(zhì)控菌株，每批次實(shí)驗(yàn)均同步進(jìn)行質(zhì)控菌株的藥敏檢測。
2.4耐藥基因測序分析
選取經(jīng)oCelloScope微生物快速藥敏監(jiān)測系統(tǒng)檢測確定為唑類耐藥的33株念珠菌（白念珠菌6株、光滑念珠菌14株、熱帶念珠菌11株、克柔念珠菌1株、近平滑念珠菌1株），按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒的說明書步驟，提取菌株的基因組DNA。參考GenBank數(shù)據(jù)庫中念珠菌相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，包括ERG11基因和PDR1基因。
PCR反應(yīng)體系為25μL，各組分的體積配比如下：上下游引物各1μL，dNTP（mix）1μL，Taq酶0.2μL，PCR緩沖液2.5μL，ddH?O 18.3μL。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)定為：①預(yù)變性階段：94℃恒溫5 min；②擴(kuò)增階段：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；③終延伸階段：72℃恒溫8 min。將純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司，采用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行雙向測序。
測序完成后，利用SnapGene 4.1.8軟件將獲得的菌株目的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的標(biāo)準(zhǔn)基因序列進(jìn)行比對分析，明確菌株目的基因是否存在突變以及具體的突變位點(diǎn)。
2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Origin 2018軟件進(jìn)行圖表繪制。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（n）或構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；以P<;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.結(jié)果
3.1菌種分布特征
通過形態(tài)學(xué)鑒定與ITS測序，共鑒定出109株念珠菌，其中白念珠菌56株（50.45%），光滑念珠菌20株（18.02%），熱帶念珠菌17株（15.32%），克柔念珠菌8株（7.21%），近平滑念珠菌3株（2.75%）。菌株主要來源于痰液標(biāo)本87株（78.38%），其次為尿液標(biāo)本17株（15.32%）和支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本4株（3.60%）。在109株念珠菌中，白念珠菌占比最高，但非白念珠菌（光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌）合計(jì)占比40.37%，表明非白念珠菌在新疆地區(qū)侵襲性念珠菌感染中占有重要地位。
3.2抗真菌藥物敏感性檢測結(jié)果
3.2.1對兩性霉素B及5氟胞嘧啶的敏感性
多數(shù)念珠菌對兩性霉素B及5氟胞嘧啶表現(xiàn)出高度敏感性。白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌對兩性霉素B的敏感率均超過90%（91.07%~95.00%），對5氟胞嘧啶的敏感率也維持在較高水平（85.71%~95.00%）。僅少數(shù)菌株表現(xiàn)為中介或耐藥，未發(fā)現(xiàn)對兩性霉素B耐藥的菌株。
3.2.2對棘白菌素類藥物的敏感性
3種棘白菌素類藥物（卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈）對本研究中常見念珠菌均表現(xiàn)出良好的體外抗真菌活性。白念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和葡萄牙念珠菌對所有3種棘白菌素類藥物均100%敏感。熱帶念珠菌對阿尼芬凈和米卡芬凈的敏感率同樣達(dá)到100%，對卡泊芬凈的敏感率為94.12%（16/17）。光滑念珠菌對棘白菌素類藥物的敏感性相對略低，對阿尼芬凈、米卡芬凈、卡泊芬凈的敏感率分別為90.00%（18/20）、90.00%（18/20）和85.00%（17/20），且在本研究中首次發(fā)現(xiàn)1株光滑念珠菌同時(shí)對3種棘白菌素類藥物耐藥。
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