滇黃精水提物促進(jìn)羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)增殖和定植的作用機(jī)制（四）
3.4.2.2 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋和富集分析
利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，將差異基因富集在各自參與的代謝通路中。差異基因的富集可以確定不同基因所涉及的生化代謝途徑及信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。本研究將正常組與滇黃精水提物共孵育組的差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，按照差異基因注釋量大小依次排序，選取前20個(gè)通路（圖4B），有276條差異基因被注釋到5個(gè)大類中，包括人類疾病、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、生物體系統(tǒng)、代謝。差異基因主要富集在，翻譯過(guò)程（Translation）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）和核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）。差異基因富集最多的通路為代謝類途徑。
將正常組與滇黃精水提物組的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，選取最顯著的前20條通路。如圖5所示，橫坐標(biāo)Rich Factor是衡量差異表達(dá)基因中富集程度的指標(biāo)，縱坐標(biāo)為通路，圖中點(diǎn)越大代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)越多，顏色越紅代表顯著性越大。其中5個(gè)顯著富集的KEGG途徑分別為嘧啶代謝（Pyrimidine metabolism）、核糖體（Ribosome）、賴氨酸生物合成（Lysine biosynthesis）、檸檬酸循環(huán)TCA Citrate cycle（TCA cycle）、脂肪酸合成（Fatty acid biosynthesis）。
圖5 KEGG富集分析氣泡圖
3.4.3滇黃精水提物促進(jìn)L.reuteri 1.2838生長(zhǎng)、促群體感應(yīng)信號(hào)分子和抗脅迫的關(guān)鍵基因及功能分析
FPKM是用來(lái)衡量基因表達(dá)水平的常用指標(biāo)。采用FPKM定量表示不同樣本間基因的表達(dá)水平差異。
差異基因富集最多的前20條KEGG途徑中有三羧酸循環(huán)（TCA）。在生物體內(nèi)，TCA循環(huán)不僅能為生物體提供能量，還是糖類、脂類、氨基酸等代謝的中心樞紐。丙酮酸是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，處于糖酵解途徑的末端，同時(shí)又連接著己糖磷酸途徑（EMP）和TCA，處于代謝途徑中的關(guān)鍵代謝支點(diǎn)。丙酮酸由丙酮酸脫氫酶催化脫羧，轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)代謝。丙酮酸脫氫酶由三種酶（丙酮酸脫氫酶組分、二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰基酶、二氫硫辛酸脫氫酶）和六種輔助因子組成。經(jīng)滇黃精水提物處理后，給藥組丙酮酸脫氫酶（PDHA、PDHB）、二氫硫辛?；阴；D(zhuǎn)基酶（DLAT）和二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）基因的表達(dá)均上調(diào)（圖6）。PDHA和PDHB位于線粒體丙酮酸到乙酰輔酶A生物合成過(guò)程的上游或內(nèi)部，催化S-乙酰基二氫硫辛酰胺-E（S-acetyldihydro-lipoamide-E）生成。DLD將丙酮酸脫氫酶復(fù)合物中硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙?；福ɑ蚨淞蛐刘ｇ牾＾D(zhuǎn)移酶）的輔基二氫硫辛酰胺脫氫從而轉(zhuǎn)化為氧化型硫辛酰胺。dlat基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶接受丙酮酸氧化脫羧形成的乙酰基，并將其轉(zhuǎn)移至輔酶A，進(jìn)而影響循環(huán)。通路中pdhA、pshB、dlat、dld分別上調(diào)了4.96、5.94、6.69、4.18倍，能更好促進(jìn)丙酮酸脫羧形成乙酰CoA，乙酰CoA進(jìn)入循環(huán)，氧化釋放能量，從而促進(jìn)L.reuteri 1.2838的生長(zhǎng)增殖。
圖6 TCA循環(huán)差異表達(dá)基因
AI-2的合成途徑主要有2類：AI-2的經(jīng)典合成途徑和半生物合成途徑。經(jīng)典途徑信號(hào)分子AI-2的合成是由S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）經(jīng)過(guò)高半胱氨酸核苷酶（Pfs）和S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（LuxS）的一系列反應(yīng)被分解轉(zhuǎn)化成腺嘌呤、同型半胱氨酸和4，5-二羥基-2，3-戊二酮（4，5-Dihydroxy-2，3-pentanedione），簡(jiǎn)稱DPD。DPD不穩(wěn)定，能自發(fā)環(huán)化形成不同的呋喃化合物，從而形成AI-2信號(hào)分子或AI-2的前體物質(zhì)。LuxS肩負(fù)著代謝和信號(hào)傳遞的雙重功能，是AI-2合成路徑中的關(guān)鍵基因，如圖7所示，與滇黃精水提物共孵育組luxS基因表達(dá)量顯著高于正常組。
圖7群體感應(yīng)通路差異表達(dá)基因
NprR-NprX系統(tǒng)是一種群體感應(yīng)機(jī)制，能通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)控制細(xì)菌的存活。Sec基因能影響NprX信號(hào)肽前體，促使NprX信號(hào)肽與NprR結(jié)合，激活NprR、脂肽表達(dá)，間接作用于細(xì)菌生物膜表達(dá)。給藥組luxS、secE、secA、secG基因表達(dá)量分別上調(diào)了1.26、5.18、4.82、2.57倍，提示滇黃精水提物對(duì)L.reuteri 1.2838群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2產(chǎn)量的增加可能與luxS和Sec基因的上調(diào)有關(guān)。
胃液和小腸中的膽鹽環(huán)境會(huì)影響益生菌的增殖定植。因此提高益生菌抵抗消化道環(huán)境脅迫的能力和在消化道內(nèi)存活率是其發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)。陳秋定等研究發(fā)現(xiàn)滇黃精水提物與益生菌L.reuteri 1.2838共孵育后，菌株群體感應(yīng)分子AI-2的生成量、抗胃腸道脅迫能力和抗饑餓脅迫能力都得到提高。提示滇黃精水提物對(duì)L.reuteri 1.2838抗酸、抗膽鹽以及黏附等益生菌功能方面有促進(jìn)作用。
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