副溶血弧菌活菌計數方法：MTT比色法、ATP生物發光法和高通量生長曲線法（一）
摘要：以一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作為研究對象，比較了MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]比色法、ATP生物發光法和高通量生長曲線法在活細菌高通量計數上的應用效果。用96孔培養板進行不同濃度細菌活菌計數，確定了上述3種方法在副溶血弧菌活菌計數的標準曲線和線性范圍。結果顯示，副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT產物甲瓚在555 nm的吸光度(OD555 nm)為計數依據，活菌數的對數(LgC)與LgOD555 nm線性關系的標準曲線為LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125)，相關系數R2=0.9965，線性檢測范圍為7.8×106~2.5×108 CFU/ml；ATP生物發光法以ATP產生的相對發光度值(RLU)為計數依據，LgC與LgRUL線性關系的標準曲線為LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366)，相關系數R2=0.9994，線性檢測范圍為1.0×104~3.0×108 CFU/ml；高通量生長曲線法以生長曲線達到拐點的時間(Ts)為計數依據，LgC與Ts線性關系的標準曲線為LgC=-(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572)，相關系數R2=0.9924，線性檢測范圍為1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3種方法對實際菌液測量并與平板計數法比較表明，ATP生物發光法與高通量生長曲線法有很好的準確性，MTT比色法準確度稍差，而高通量生長曲線法有最寬的線性范圍，也最適合高通量測定。
細菌計數方法是微生物學研究的基礎技術，主要分為直接計數法和間接培養計數法。直接計數法主要有顯微鏡觀察法(包括光學顯微鏡技術、熒光顯微鏡技術等)和比濁計數法等；間接培養計數法主要有平板菌落計數法(包括傳統平板計數法、微菌落技術等)和最大或然數計數法(Most probable number，MPN法，也稱為稀釋培養法)等(王婷婷等,2008)。傳統的直接計數法不能區分細菌的死活，且靈敏度低、線性范圍狹窄，間接培養計數法雖然能確定活菌數量，但工作量大，難以對大批量樣品進行同時操作。例如，食品安全國家標準中的菌群計數法采用MPN法和平板計數法(GB 4789.3-2010)，這2種方法都需要培養24~48 h，且工作量大、檢測線性范圍窄，難以進行快速、大批量的檢測工作，MPN法的精確性還存在疑問；為了簡化檢測程序、縮短檢測時間，國內外學者進行了大量的快速檢測方法的研究，提出了電阻抗檢測法、Sim PlateTM全平皿計數法、微菌落技術、最大或然數-聚合酶鏈式反應計數法(MPN-PCR法)、流式細胞儀測定法等檢測方法，取得了一定的成果，但也存在不同的缺陷和不足。例如，流式細胞儀測定法雖然靈敏度、簡便性都有了較大的提升，但由于其成本昂貴，且不能區分細菌的死活，在實際應用中受到了很大的制約。
MTT是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，能穿過細胞膜被活細胞線粒體中的琥鉑酸脫氫酶還原，形成藍紫色不溶于水的甲瓚(Formazan)(Mosmann,1983)，死細胞酶活性喪失而沒有顏色反應。用有機溶劑溶解甲瓚后(邊興艷,1998)，測定溶液的吸光度(OD值)而確定活細胞數(Gerlier et al,1986)。該法快速、經濟、操作相對簡便、重復性較好，近年來被廣泛應用到大腸桿菌(Escherichia coli)(王栩等,2002)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)(黃立坤等,2008)、伴放線菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)(王忠朝等,2010)和酵母菌(龔加路等,2016)等的活菌計數中。
三磷酸腺苷(ATP)是所有生命活動的能量載體(Velten et al,2007)，活細菌中ATP含量會維持在一定范圍，細菌死亡后ATP會在短時間內被細胞內酶所分解(Holm-Hansen et al,1966)，樣品中ATP含量即可間接反映活細菌數量。ATP生物發光法(Miller et al,1992;Selan et al,1992;Nyrén,1994;McElroy et al,1949)是熒光素酶在Mg2+條件下催化熒光素與ATP反應形成熒光素-AMP的復合物，與O2結合時發光，發光強度與ATP濃度呈線性關系，從而檢測活菌的數量(Moyer et al,1983;Gr?nroos et al,1983)。ATP生物發光法操作簡便，能快速得到結果，與傳統的平板計數法相比，不僅能區分細菌的死活，而且還能檢測出不可培養的微生物(Hammes et al,2010)。
借鑒實時定量PCR的擴增曲線原理，利用微生物類似于PCR擴增的指數生長曲線(Brewster,2003)，建立了高通量生長曲線法，該法與傳統的MPN法完全不同，是根據細菌生長達到特定濁度的時間進行活菌的計數，在微孔板的微量培養體積上，設置多個平行，以高通量的方式對微生物的生長進行實時監測，達到類似實時定量PCR那樣在極寬的線性范圍進行微生物的準確計數的效果。在上述背景下，本研究對MTT比色法、ATP生物發光法和高通量生長曲線法進行了比較。
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