棘孢木霉TCS007菌株的固態發酵條件、次生代謝產物產量影響因素（一）
植物病原真菌是農業生產中的主要威脅之一，不僅會導致作物減產，還可能引發嚴重的病害流行，給全球糧食安全帶來巨大挑戰。傳統的化學殺菌劑雖然在防治植物病害方面發揮了重要作用，但其長期使用也導致了病原菌抗藥性的增加，對環境和人類健康造成負面影響。因此，開發環境友好、高效、低殘留且可持續的生物防治方法成為了當前研究的熱點。
木霉屬(Trichoderma)真菌是一類廣泛存在于土壤中的有益微生物，具有廣譜的抑菌活性，能夠抑制多種植物病原真菌的生長。近年來，木霉及其代謝產物在生物防治中的應用受到了廣泛關注。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)作為木霉屬中的一種，已被證明其代謝產物中含有多種具有生物活性的次生代謝物，如木霉菌素、吡喃酮類化合物等，其中的6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-pentyl-2-pyrone)對植物病原真菌具有顯著的抑制作用，并且還能夠誘導植物的系統抗性、促進植物生長。
不同微生物生長所需的營養環境各異，根據微生物的生長特性，需要采用特定的培養基，因此，篩選優化培養基組分與培養條件是實現微生物源藥劑最大化生產的必要步驟。固態發酵(solid-state fermentation，SSF)是一種利用固體基質進行微生物發酵的技術，具有成本低、操作簡便、產物濃度高等優點。與液態發酵相比，固態發酵更有利于木霉菌的生長和代謝產物的積累。固態發酵基質在為微生物提供碳、氮、無機鹽等營養物質的同時，還可為微生物生長及代謝提供載體。通過優化固態發酵條件，可以顯著提高木霉菌的代謝產物產量及其抑菌活性。響應曲面法(response surface methodology，RSM)可用于研究多個影響因素之間的相互作用，同時預測變量的最佳值，是微生物發酵優化中常用的準確高效的方法之一。
棘孢木霉菌株由本研究團隊分離自南極海洋沉積物(菌株號：HTTA-Z0002)，經誘變穩定后鑒定并命名為棘孢木霉TCS007(T.asperellum TCS007)菌株，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.15677，菌株及其功能首次公布于中國發明專利ZL 201810935616.6和ZL 201810936028.4。前期研究已明確，TCS007菌株對油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)和黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)等多種植物病原菌均有較好的抑制效果，并且發現其液體發酵濾液稀釋10倍及粗提發酵產物(crude fermentation extracts，CFE)在10 mg/L質量濃度下對油菜菌核病菌的抑制率均可達到95%，由此推測其產生的代謝產物中含有活性較強的抑菌物質。此外，TCS007菌株能誘導向日葵產生系統抗性，防治由核盤菌引起的向日葵菌核病，還能誘導蠶豆、黃瓜和水稻對干旱、低溫和鹽堿的耐受性。可見，TCS007菌株作為生物農藥和生物肥料都具有廣闊的應用前景。前期研究表明，大米固態培養基發酵所得次生代謝產物產量明顯高于液體培養基發酵。本研究旨在通過單因素試驗和響應曲面法，進一步優化棘孢木霉TCS007菌株的固態發酵條件，以期提高其次生代謝產物產量，并探究其代謝粗提產物對油菜菌核病菌等植物病原真菌的抑制活性，為棘孢木霉TCS007菌株后續產品開發的發酵工藝確定和實際應用提供理論指導。
1材料與方法
1.1試驗材料與儀器
1.1.1供試菌株
生防真菌：棘孢木霉TCS007(T.asperellum TCS007)菌株由浙江農林大學綠色農藥協同創新中心分離，于?80℃冰箱中保存，備用。
植物病原真菌：油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、蘋果褐斑病菌(Marssonina coronaria)、黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、果生刺盤孢(Colletotrichum fructicola)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、草坪幣斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)、玉米彎孢葉斑病菌(Curvularia lunata)，均由本實驗室分離、保存和鑒定。
1.1.2培養基
PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水補至1 L，121℃滅菌15 min。
初始固態發酵培養基：300 mL三角瓶中加入大米72 g，蒸餾水48 mL，121℃滅菌15 min。
1.1.3藥劑及試劑
97.5%啶酰菌胺(boscalid)原藥，浙江宇龍生物科技有限公司提供。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、無水Na2SO4、HCl、NaOH、NaCl、MnSO4、MgSO4、CaCl2、FeCl3和尿素均為分析純。
1.1.4主要儀器
BSA233S電子精密天平(精確到0.001 g，賽多利斯科學儀器有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌鍋(松下健康醫療器材有限公司)；MJ-150-I霉菌培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DHG-9030A臺式鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；μCount3D立體計數儀(丹麥BioSense公司)；Axio Lab.A1 pol光學顯微鏡(歐波同有限公司)。