脂肽對蜜蜂球囊菌生長抑制作用及其孢子萌發的影響（一）
摘要
目的:探究脂肽對蜜蜂球囊菌的抑制作用和機制，以及其體外抑菌和殺菌活性。方法:通過形態學和分子生物學等方法鑒定蜜蜂球囊菌，采用抑菌圈試驗法驗證脂肽能否抑制蜜蜂球囊菌生長，采用倍比稀釋法測定脂肽對蜜蜂球囊菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺真菌濃度(MFC)。采用BioSense微生物快速立體計數儀觀察脂肽對蜜蜂球囊菌孢子萌發的影響;高效液相色譜法測定蜜蜂球囊菌細胞膜中麥角甾甾醇和細胞壁中幾丁質含量，確定脂肽Iturin對蜜蜂球囊菌是否存在抑制作用。
結果:顯微鏡觀察發現，分離菌菌絲呈有隔膜的分枝狀和具有球形的孢子囊、孢子等形態。18S rDNA測序結果顯示，分離菌與蜜蜂球囊菌(GenBank登錄號:GQ867785.1)序列相似性為100%，確定獲得的菌株為蜜蜂球囊菌。脂肽伊枯草菌素(Iturin)對蜜蜂球囊菌的抑制作用最好，抑菌圈半徑達8.53mm，豐原素(Fengycin)抑菌圈半徑為5.84mm，表面活性素(Surfactin)無抑制作用。Iturin對蜜蜂球囊菌的MIC為6.25~25μg/mL,MIC??、MIC??和MFC分別為6.25、25和50μg/mL。與0μg/mL Iturin處理組相比，6.25、12.5、25和50μg/mL Iturin處理組蜜蜂球囊菌孢子萌發率均顯著下降(P<0.05)。麥角甾甾醇含量測定結果顯示，與0μg/mL Iturin處理組相比，12.5、25和50μg/mL Iturin處理組蜜蜂球囊菌細胞膜麥角甾甾醇含量均顯著下降(P<0.05)。幾丁質含量測定結果顯示，與0μg/mL Iturin處理組相比，25和50μg/mL Iturin處理組蜜蜂球囊菌細胞壁幾丁質含量顯著下降(P<0.05)。結論:脂肽Iturin通過減少孢子萌發，破壞細胞膜中麥角甾甾醇的生物合成及損害細胞壁中幾丁質的合成來有效抑制蜜蜂球囊菌。
1材料與方法
1.1材料
?菌株:蜜蜂球囊菌源自患白堊堊病蜜蜂幼蟲，經純化培養所得，患病蜜蜂幼蟲由中國農業科學院蜜蜂研究所提供。
?主要試劑和儀器:Surfactin、PI染液均購自上海源葉生物科技有限公司;Fengycin購自南京翼飛雪生物科技有限公司;Iturin購自上海皓元生物醫藥科技有限公司;麥角甾甾醇標準品購自北京百靈威科技有限公司;甲殼素標準品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;D(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽購自上海麥克林生化科技有限公司;氯甲酸-9-芴基、甲酯(FMOC-CL)均購自北京華威銳科化工有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)購自北京奧博星生物科技有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基購自北京陸橋技術股份有限公司。硼酸鈉溶液配制:稱一定量的硼酸，用NaOH將pH調至中性，并使其濃度為0.2mol/L。脂肽溶液的配制:將脂肽Surfactin、Fengycin、Iturin分別溶于甲醇溶液中使其濃度為1mg/mL，備用。
生化培養箱購自上海精宏實驗設備有限公司;生物安全柜購自NuAire公司;PCR儀購自杭州博日科技有限公司;凝膠成像分析儀購自杭州米歐儀器有限公司;液相色譜儀購自安捷倫科技有限公司;激光共聚焦顯微鏡和體式顯微鏡均購自徠卡公司;BioSense微生物快速立體計數儀購自丹麥BioSense公司;光學顯微鏡購自OLYMPUS公司;滅菌鍋、電子天平、烘干箱、離心機、測微尺。
1.2方法
1.2.1分離菌形態學鑒定
分離菌顯微觀察及測量:將純化菌株產生的黑色子實體和白色菌絲分別置于載玻片上并滴一滴無菌水，混合均勻，蓋上蓋玻片，在體式顯微鏡下進行觀察，在普通光學顯微鏡下用測微尺測量其大小，取4組球囊菌，每組重復測定3次。
1.2.2分離菌分子生物學鑒定
用真菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌DNA，設計真菌通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',PCR擴增18S rDNA，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系和反應程序參照戚偉等方法。PCR反應體系50μL:2xTaq Master Mix(Dye)25μL,模板DNA 1μL,上、下游引物(10μmol/L)各2μL,ddH?O 20μL。PCR反應程序:98℃預變性2min;98℃變性10s,54℃退火70s,72℃延伸10s,共35個循環;72℃延伸5 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結果,并將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。