產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體分離、超離、宿主譜鑒定及生長曲線繪制（一）
李氏桿菌可污染奶制品、肉制品、水產(chǎn)品以及即食食品等，是重要的食源性致病菌之一。目前常見的李氏桿菌共有7種，其中,產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(，)是唯一能引起人類疾病的。當(dāng)攝入被產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌污染的食品后，孕婦、嬰幼兒及老人等免疫低下人群極易罹患李氏桿菌病，其致死率高達(dá)23.6%。由于缺乏完善的監(jiān)測系統(tǒng)，產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的低溫生長等特性，李氏桿菌病仍作為世界四大食源性疾病，給人畜帶來嚴(yán)重危害。
由于過度使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加和超級細(xì)菌的出現(xiàn)，有望將噬菌體視為可能的抗生素補充或替代品。噬菌體在治療細(xì)菌性感染方面，較抗生素其優(yōu)勢：嚴(yán)格的宿主特異性、增殖速度快、研發(fā)時間短、成本低、安全無污染等?；谝陨咸攸c，雖然國內(nèi)外已有將噬菌體用于疾病治療及食品生產(chǎn)加工方面的報道，但噬菌體的應(yīng)用也存在一些缺陷。由于噬菌體的高度特異性，單一的噬菌體或給藥途徑的治療方式，效果并不十分明顯。根據(jù)目前對其他噬菌體的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體和抗生素聯(lián)用取得的效果比單一噬菌體或抗微生物藥物給藥所取得的治療效果更為顯著。
本試驗主要利用實驗室保存的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌為宿主菌，使用雙層瓊脂平板法從屠宰污水樣品中分離出噬菌體，通過對其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、基因組學(xué)等方面進(jìn)行鑒定。旨在評價分離到的噬菌體在預(yù)防和治療產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌病過程中的效果以及應(yīng)用價值，為實驗室后續(xù)建立產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體庫和基于產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣本來源分別從甘肅省定西市、武威市某屠宰場，采集污水樣品，4℃保存。
1.1.2菌株來源甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生實驗室保存的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌、威爾斯李氏桿菌和英諾克李氏桿菌。
1.2分離和純化
離心并過濾后的樣品進(jìn)行共孵育，37℃，震蕩培養(yǎng)24 h，分離時采用雙層瓊脂平板法，瓊脂比例為上層1.2%，下層0.5%。挑取單個噬菌斑，進(jìn)行雙瓊脂平板培養(yǎng)，重復(fù)5～6次，得到單一噬菌體。
1.3濃縮和超離
噬菌體裂解液與宿主菌各100μL混合，37℃，共孵育15 min后，加入100 mL TSB-YE培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min培養(yǎng)12 h，利用PEG8000沉淀法進(jìn)行沉淀。對噬菌體濃縮液進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，進(jìn)一步提高效價以及純化噬菌體顆粒(噬菌斑的解離條件為4℃過夜解離，濃縮中加入PEG8000后冰浴4 h)。
1.4效價的測定
噬菌體濃縮液進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋。選取合適的梯度進(jìn)行培養(yǎng)、計數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。噬菌體效價(滴度)的計算方法：
噬菌體效價(PFU·mL)=密度適當(dāng)平板上的噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。
1.5電鏡觀察
取5μL超速離心后的噬菌體樣品滴加到300目銅網(wǎng)上吸附10 min。濾紙吸干噬菌體溶液，滴加5μL的1%磷鎢酸溶液復(fù)染2 min后，吸除染液。室溫晾干后，電鏡觀察。
1.6生長特性鑒定
1.6.1宿主譜的測定利用不同菌株與噬菌體LP8進(jìn)行混合孵育后，利用雙層瓊脂平板法計算噬菌體效價(PFU)，計算宿主菌與受試菌電鍍效率(EOP)，計算公式為EOP=受試菌平均PFU/宿主菌平均PFU。
1.6.2溫度設(shè)定25、35、45、55、65、75℃不同的溫度梯度，將噬菌體裂解液置于其中孵育30 min后進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)平板計數(shù)確定該噬菌體的最適溫度和失活溫度。
1.6.3 pH將噬菌體液加入pH為2、4、6、7、8、10、12的SM緩沖液中，37℃孵育1 h，通過培養(yǎng)來確定該噬菌體的最適pH。
1.6.4有機溶劑在噬菌體液(1×10PFU·mL)中等體積加入異戊醇、丙三醇、甲醇、乙醇、氯仿和硫酸鎂緩沖液(SM緩沖液)。37℃作用30 min后，測定效價。
1.6.5一步生長曲線測定通過對噬菌體-宿主菌共培養(yǎng)液，不同時間點(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min)取混合物進(jìn)行培養(yǎng)，測定噬菌體的效價，繪制一步生長曲線，確定噬菌體的潛伏期等。
1.6.6最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測定對細(xì)菌和噬菌體進(jìn)行定量，設(shè)置不同的感染比例(0.001、0.01、0.1、1、10、100)進(jìn)行共孵育，培養(yǎng)后計算出不同感染復(fù)數(shù)下的噬菌體效價(見“1.4”)，試驗重復(fù)3次，并確定噬菌體的MOI。
1.7全基因組測序
利用Tris法對噬菌體超離液中的噬菌體顆粒進(jìn)行基因組提取。在所提取的基因組中加入DNaseⅠ、RNaseⅠ和綠豆核酸酶，對基因組進(jìn)行酶切、電泳，鑒定基因組類型。將成功提取的噬菌體基因組送至廣東惠通生物科技有限公司，采用Illumina測序技術(shù)完成噬菌體基因組掃描測序，構(gòu)建了Illumina PE文庫，對獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后利用生物信息學(xué)分析手段完成噬菌體的全基因組組裝。利用基因組繪圖軟件Snap Gene繪制基因組圖，對其相應(yīng)基因進(jìn)行預(yù)測分析。
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