貝氏柯克斯體在高滲脫水環境中的生物學特性研究（一）
摘要
目的基于無生命培養體系,探索建立貝氏柯克斯體耐受脫水的實驗室研究模型。方法梯度調整貝氏柯克斯體無生命培養體系中的滲透壓條件,利用qPCR定量測定不同滲透壓下貝氏柯克斯體在培養周期內基因組拷貝數變化并描記生長曲線,進一步利用相差顯微鏡、透射電子顯微鏡對真核細胞以及無細胞培養方法所得貝氏柯克斯體進行形態學分析,并感染BGMK細胞測定不同滲透壓培養所得貝氏柯克斯體的感染性VFU。結果貝氏柯克斯體可在高滲透壓條件的無生命培養基中適應性生存7 d以上,經高滲透壓培養后的菌體脫水收縮且大小類似于小貝氏體,同時感染后24 h的VFU較對照組降低。結論成功建立了貝氏柯克斯體耐受高滲壓脫水的研究模型,為下一步用蛋白質組學等方法研究貝氏柯克斯體在自然環境中耐受干燥脫水的遺傳學機制奠定了基礎。
貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii,C.burnetii)是一種世界范圍廣泛存在的革蘭氏陰性細胞內寄生菌,可通過氣溶膠吸入方式傳播感染人導致不明熱(Query fever,Q熱),故又稱Q熱立克次體。該病原對各種自然環境的抵抗力強,可耐受多種外界失活條件如化學試劑、紫外輻照以及干燥脫水而存活致病,因而又被聯合國列為經典的生物戰劑與生物恐怖劑。傳統上,由于貝氏柯克斯體專性胞內寄生的繁殖特性,一直以來該病原的研究局限于體內實驗模型,如豚鼠等哺乳動物的感染、雞胚接種以及細胞培養等,極大限制了該菌對脫水等無生命環境的耐受性研究。近年來,隨著多種無生命培養方法(Acidified Citrate Cysteine Media,ACCM)的研制,為進一步研究貝氏柯克斯體耐受高滲透壓干燥脫水的生物學特性提供了全新技術平臺。
在自然環境中,目前貝氏柯克斯體被認為大多以耐受干燥脫水環境的毒力菌株小貝氏體(Small Cell Variants,SCVs)存在,相反的,在體內繁殖生長時,貝氏柯克斯體表現為雙相發育周期,即在單個繁殖周期(7 d)內,由形態較小(<1μm)且具有感染性的小貝氏體(SCVs)向繁殖狀態的大貝氏體LCV(>0.5μm)轉變。這提示我們可利用無生命培養法在實驗室內模擬體外環境,適應性培養獲得貝氏柯克斯體并進一步評估所得菌體是否具備類似于環境野生株的菌體形態以及感染性。與大多數革蘭陰性菌的無生命培養基組分含有高濃度的K+不同,各代ACCM培養基均具有高濃度Na+(~125 mmol/L)而非K+(~5 mmol/L)。作為維持無生命培養基滲透壓以及貝氏柯克斯體二分裂繁殖外環境的重要組分,Na+與Cl-終濃度的變化可以使菌體暴露在高滲壓脫水環境下,從而可實驗室內模擬外界環境中的脫水條件。本研究以無生命培養體系為基礎,實驗室模擬外界脫水環境并對適應性存活的貝氏柯克斯體生物學特性進行了評價,目的是在本實驗室內建立貝氏柯克斯體耐受高滲壓脫水的研究模型。
1材料與方法
1.1材料和儀器
貝氏柯克斯體九里II相菌株(Nine Mile phase II,NM II)、綠猴腎細胞(BGMK)均由本科室超低溫保存;全基因組DNA純化提取試劑盒、實時熒光定量PCR檢測試劑購自美國Qiagen公司;PCR反應所需引物及Taqman探針由上海生工生物公司合成;實驗所用化學試劑購自上海生工公司并均為分析純級別。實時熒光定量分析儀ABI 7300購自ABI(Applied Biosystems)公司;倒置相差顯微鏡TS100購自日本尼康公司;透射電子顯微鏡H-7600購自日本Hitachi公司;恒溫低氧培養箱購自日本SANYO公司。
1.2可耐受高滲壓脫水存活貝氏柯克斯體的培養
依據國外已報道的方法,分別準確配置不含Na+及Cl-的無生命培養基ACCM-2(-NaCl),以及終濃度為0.3 g/mL的氯化鈉母溶液。將氯化鈉母溶液分別以終濃度1 250 mmol/L、125 mmol/L、1.25 mmol/L加入24孔板內的ACCM-2(-NaCl)無生命培養基中,完成高滲壓組(ACCM+10×NaCl,3 500 mOsm/L)、常規組(ACCM-2,345 mOsm/L)及低滲組(ACCM+1/100×NaCl,40 mOsm/L)培養基的制備,如表1所示。分別向上述ACCM培養基中加入106拷貝的貝氏柯克斯體九里II相菌種,每組均平行重復3次實驗,后將24孔板置于2.5%O2,5%CO2,37℃的恒溫低氧培養箱中靜置培養7 d。
表1滲透壓梯度無生命培養基配制條件
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